Diagnostic des anomalies de l ADAMTS13

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1 DIU d Hémostase Lyon 2015 Diagnostic des anomalies de l ADAMTS13 Professeur Agnès Veyradier Service d Hématologie Hémostase Thrombose Hôpital Lariboisière, Paris Groupe Hospitalier Saint Louis-Lariboisière-Fernand Widal Université Paris Diderot Paris 7 université PARIS DIDEROT PARIS 7

2 Etudes hémorhéologiques des années 1980 Le facteur Willebrand (VWF) est la protéine indispensable à l adhésion plaquettaire au sous-endothélium et à l agrégation plaquettaires dans la microcirculation sanguine Agrégation Plaquette plaquettaire fibrinogène VWF Plaquette Plaquette Brèche vasculaire Adhésion plaquettaire VWF Endothélium Matrice sous-endothéliale

3 VWF : structure multimérique Dimère : 500 kda Tetramère : 1000 kda Hexamère : 1500 kda Régulation physiologique de la taille des multimères du VWF Multimère > kda VWF : sensibilité conformationnelle aux taux de cisaillement du flux sanguin Multimère de VWF globulaire Multimère de VWF déplié

4 La protéase de clivage du VWF : Historique Purification partielle à partir du plasma humain Méthode de dosage fonctionnel dans le plasma Modèle de pathologie humaine : le PTT Séquence peptidique (famille ADAMTS) : ADAMTS13 Gène Lieu de synthèse Depuis Relations structure / fonction. Régulation. Rôle en physiologie et pathologie humaines

5 ADAMTS13. Gène : chromosome 9-29 exons - ARNm 4,6 kb (clonage 2001). Biosynthèse : c de Ito du foie, c endothéliales, plaquettes. Sécrétion dans le plasma (conc : 1 µg/ml; demi-vie : 1 semaine). Normes dans le plasma : %. Structure : Métalloprotéase de la famille ADAMTS (A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin type 1 motifs) Glycoprotéine monocaténaire de 190 kda ac am. Fonction : Protéase spécifique de clivage du facteur Willebrand. Déficit sévère : Purpura Thrombotique Thrombocytopénique (PTT)

6 La famille ADAMTS

7 Structure d ADAMTS13 Site catalytique (Ca ++) (Zn ++) Récepteurs cellulaires (CD36 endothélial)? N Metalloprotease Desint. TSP 1 Cys Spacer TSP 2 TSP 3 TSP 4 Intégrines RGDS Chaîne 3 des intégrines TSP 5 TSP 6 TSP 7 TSP 8 CUB CUB C

8 Domaines d interaction entre ADAMTS13 et son substrat Partie N-terminale indispensable au clivage du VWF in vitro ADAMTS13 métallo désint TSP 1 Cyst. spacer CUB CUB Liaison en flux in vitro Facteur Willebrand (VWF) [monomère = SU mature] Tyr842-Met843 D D3 A1 A2 A3 D4 B1 B2 C1 C2 CK VWF EQAPNLV YM VTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIG VGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPR EAPDLVLQR VWF73 = Substrat minimal pour ADAMTS13 in vitro

9 Fonction du couple VWF-ADAMTS13 Sujet Normal Multimères de HPM de VWF Multimères de VWF clivés CD 36? Cellules endothéliales Cellules endothéliales Sécrétion des multimères de THPM à partir des corps de Weibel-Palade

10 Fonction du couple VWF-ADAMTS13 Sujet Normal Patient atteint de PTT Agrégation spontanée des plaquettes Libération de thrombi Plaquettes CD 36?

11 Variations physiologiques d ADAMTS13 Conditions ayant en commun une augmentation physiologique du taux de VWF : diminution d ADAMTS13. Âges extrêmes de la vie : nouveau-nés et sujets âgés ADAMTS13 plus basse de 10-20% p/r à la population générale. Sujets noirs ADAMTS13 plus basse de 10-20% p/r aux sujets blancs. Au cours de la grossesse ADAMTS13 diminue progressivement à partir de 12 SA pour atteindre à terme, des taux inférieurs de 15-20% p/r au taux de base de la patiente

12 Déficits fonctionnels en ADAMTS13 I- Déficits partiels en ADAMTS13 (Activité entre 10 et 45%). Non spécifiques, retrouvés dans de nombreuses pathologies : sepsis sévère, hépatopathies, HTA maligne, paludisme, MAT telles que SHU, HELLP syndrome, PTT «non classiques» associés aux greffes d organes, aux cancers, au VIH. Pertinence clinique???. Mécanismes : consommation par excès de substrat, diminution de synthèse/sécrétion, inhibition catalytique par IL6, dégradation protéolytique par enzymes protéolytiques (thrombine, élastases leucocytaires ) II- Déficit sévère en ADAMTS13 (Activité <10%). Pathognomonique du PTT. Marqueur diagnostique sensible et spécifique. Marqueur pronostique probable. Mécanismes : auto-anticorps ou mutations génétiques

13 PTT : définition. Anémie hémolytique mécanique (schizocytes). Thrombopénie de consommation. +/- ischémie multiviscérale (cerveau, rein )

14 Thrombi de la microcirculation dans différents organes d un patient atteint de PTT rein surrénale colon pancréas coeur foie

15 PTT : historique, épidémiologie. Historique. Adulte : Syndrome de Moschcowitz (1924). Enfant : Syndrome d Upshaw-Schulman (1960). Prévalence 4 à 10 cas / million d habitants / an - (maladie rare). Age de révélation (1ère poussée) Enfance (naissance -> adolescence) : <10% des cas Adulte : ans, sex ratio 2F/1H : >90% des cas. Evolution par poussées (entrecoupées de rémission). sporadiques. Formes cliniques. récurrentes (parfois familiales). Idiopathiques (~50% des cas). Secondaires : infections, grossesse, MAI, médicaments (~50% des cas)

16 Les grandes étapes de la compréhension physiopathologique du PTT de 1982 à 2001

17 Structure multimérique du VWF plasmatique dans le PTT - multimères de THPM + PTT Normal - dimère Moake et al, Blood 1982

18 Histopathologie du PTT Microangiopathie thrombotique souffrance endothéliale Microvaisseaux Thrombi de plaquettes + VWF Asada et al, Thromb Res 1985

19 Physiopathologie du PTT (1) Purification d une protéase spécifique de clivage du VWF : VWF-CP Furlan et al, Blood 1996 L activité plasmatique de la VWF-CP est effondrée (<5%) chez les patients atteints de PTT Furlan et al, Blood 1997 Le déficit fonctionnel sévère de la VWF-CP dans le PTT est :. soit acquis par le biais d auto-anticorps spécifiques. soit probablement constitutionnel (cas familiaux) Furlan et al, NEJM 1998 Tsai et al, NEJM 1998

20 Physiopathologie du PTT (2) Le clonage du gène de la protéase spécifique de clivage du facteur Willebrand a permis :. de l identifier comme le 13ème membre de la famille ADAMTS (A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin type 1 repeats) : ADAMTS13. de montrer qu il existe bien des cas héréditaires de PTT par le biais de mutations récessives du gène d ADAMTS13 : maladie orpheline = Syndrome d Upshaw-Schulman Levy et al, Nature 2001

21 Physiopathologie du purpura thrombotique thrombocytopénique Déficit fonctionnel sévère <10% en ADAMTS13 Acquis (auto-anticorps anti-adamts13) Héréditaire (mutations du gène d ADAMTS13) Accumulation de très grands multimères du VWF très adhésifs en circulation dans le plasma Formation spontanée de thrombi plaquettaires dans la microcirculation sanguine Facteurs favorisants Anémie hémolytique mécanique Thrombopénie de consommation Ischémie multiviscérale

22 Le PTT lié à un déficit sévère héréditaire en ADAMTS13 Syndrome d Upshaw-Schulman

23 Syndrome d Upshaw-Schulman Epidémiologie. Maladie orpheline : moins de 10% de tous les cas de PTT prévalence <0,5 pour 1 million. Une centaine de patients décrits dans la littérature. Répartition mondiale ubiquitaire : Amérique du Nord (USA, Canada) Europe (UK, France, Allemagne, Autriche, Suisse, Italie, Portugal, Yougoslavie, Suède) Asie (Japon, Chine, Iran, Koweit, Turquie) Australie Afrique (Maghreb) Peu de mutations d ADAMTS13 communes entre les différents pays

24 Syndrome d Upshaw-Schulman Phénotype clinique variable. Age de révélation. à la naissance +++ (ictère, hémolyse, thrombopénie). dans la petite enfance ++. à l âge adulte : mutation R1060W, grossesse. Sévérité des poussées. bicytopénie hématologique.. ischémie multiviscérale parfois irréversible (insuffisance rénale terminale, séquelles d AVC, d IDM ). Fréquence des poussées :. périodes de rémission de durée variable (mois, années). ou maladie chronique (rémission < 1 mois)

25 Syndrome d Upshaw-Schulman Phénotype biologique invariable. Activité plasmatique ou sérique d ADAMTS13 < 10%. Antigène d ADAMTS13 le plus souvent indétectable < 65 ng/ml. Autoanticorps anti-adamts13 négatifs. Titre d IgG anti-adamts13 < 15 UI/dl. Activité inhibitrice circulante anti-adamts13 indétectable

26 Syndrome d Upshaw-Schulman Génotype. Une centaine de mutations d ADAMTS13. Transmission autosomique récessive (maladie orpheline) :. Les patients sont double hétérozygotes ou homozygotes. Parmi les homozygotes (~15 mutations) : consanguinité. Répartition sur toute la longueur du gène. Mutations faux-sens : 70% / Mutations de terminaison : 30%. Pas de délétion totale du gène (létale?). Mécanismes : déficit quantitatif ou qualitatif d ADAMTS13

27 Mutations d ADAMTS13 dans le syndrome d Upshaw-Schulman R7W Q44X* I79M V88M* A95P H96D R102C S119F R193W* T196I S203P L232Q H234Q D235H A250V* S263C R268P C311Y C322G T323R F324L R328G C347S P353L C365X* W390C* W390X R398H E444G Q448E Q449X* P457L P475S R507Q C508Y* R528G A596V P618A R625H A631V P671L I673F P671L T673F* R692C C695W A732V C758R Q802X E812X A900V S903L C908Y* C908S R910X C951G H960D C977W W1016X C1024G A1033T R1034X R1060W* R1095W R1096X R1123C* R1206X C1213G* C1213Y I1217T R1219W* C1239V* W1245X* K1256F K1256S R1336W D1362V Métalloprotéase Desint. TSP 1 Cys Spacer TSP 2 TSP 3 TSP 4 TSP 5 TSP 6 TSP 7 TSP 8 CUB1 CUB2 Splice : In3 : G>A In4 : G>A In6 : 686+1>A 686+1T>G Frameshift : Ex7 : del G+C Mutations de novo Mutations françaises Mutations exprimées dans des recombinants* Splice : In8 : C>T or +69C>T Int/ex8 : 8 bp del Ex 9 : G>A Splice : In10 : T>G C>G Splice : In 13 : +2T >A G>A C>G T>C Ex12 : G>A Splice : In15 : G>A Frameshift : TT del Frameshift: Ex19 : 2279G>A 2279delG 2376del26 Frameshift: Ex20 : 2549delAT Splice : In22 : C>T Frameshift: Ex27 : 3769insT Splice : In28 : T>C Frameshift : 4143insA

28 Le PTT lié à un déficit sévère acquis en ADAMTS13 (Syndrome de Moschcovitz)

29 PTT par déficit sévère acquis en ADAMTS13. 90% de tous les PTT lié à déficit sévère en ADAMTS13. Prévalence : 4 à 10 cas par million d habitants / an. Age : adultes +++ (âge de la 1ère poussée : ans). Sex ratio : 2F / 1H. Contexte : idiopathique / contexte clinique associé. Mécanismes. autoimmunité (IgG anti-adamts13) : 90% des cas. autres (défaut de synthèse/sécrétion, dégradation, inhibition ) : 10% des cas

30 PTT par déficit sévère acquis en ADAMTS13 Phénotype clinique variable. Age de révélation de la maladie : adulte >>>>> enfant (rares cas chez grands enfants et adolescents). Caractère idiopathique = contexte clinique associé (maladies auto-immunes LED SAPL ). Degré de l atteinte ischémique (thrombopénie -> ischémie multiviscérale). Fréquence des poussées (récurrentes sporadiques -> chroniques). Exigences thérapeutiques (plasmathérapie +/- immunosuppresseurs) Phénotype biologique variable IgG anti-adamts13 : détectables dans ~70% des cas

31 Auto-anticorps anti-adamts13 dans le PTT acquis (1). Dans 75% des PTT acquis : IgG combinant une activité inhibitrice et une complexation à l antigène. Rarement : IgM et/ou IgA. Polyclonaux et toujours dirigés contre le domaine Cys-rich d ADAMTS13. Associés d emblée ou précèdent l apparition d autres auto-ac (FAN)

32 Auto-anticorps anti-adamts13 dans le PTT acquis (2). Induisent le déficit sévère acquis de l activité d ADAMTS13 retrouvé en poussée de PTT. Le plus souvent, disparaissent en rémission clinique, parallèlement à une normalisation de l activité d ADAMTS13. Parfois, persistent en rémission clinique : - à un titre élevé, parallèlement à une ADAMTS13 indétectable - à un titre moindre, parallèlement à une ADAMTS13 détectable

33 ADAMTS13 dans les MAT Expérience du CNR-MAT (Centre National de Référence des MicroAngiopathies Thrombotiques)

34 ADAMTS13 en France : historique U143 Inserm/ Hématologie A. Béclère (D. Meyer) Méthode originale de mesure d ADAMTS13 activité (ELISA VWF full-length) et application aux MAT Thèse de Sciences A. Veyradier U143 Inserm/ Hématologie A. Béclère (D. Meyer/A.Veyradier) Nouvelles méthodes d investigation d ADAMTS13 FRETS-VWF73 IgG anti-a13 Séquençage gène A13 U770 Inserm (C. Denis) Souris KO ADAMTS13 Laboratoire de génétique, CHU Nantes (P. Boisseau, S. Bezieau) Génotypage d ADAMTS Réseau clinico-biologique d étude des MAT Cliniciens: réanimateurs, hématologues, néphrologues, internistes Biologistes: ADAMTS13 : Hémato A. Béclère/U143 Inserm Complément: Immunologie HEGP Thèse d exercice médecine P. Coppo PNMR 1: 3 ème vague de labellisation Centre National de Référence des MicroAngiopathies Thrombotiques (CNR-MAT) Coordonnateur : P. Coppo 50 Équipes cliniques (sites CNR + CC) Labos référents: ADAMTS13 : A. Veyradier Complément : V. Frémeaux-Bacchi Expertise HAS Renouvellement CNR-MAT (PNMR2)

35 Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT : historique De la recherche clinique au diagnostic médical Réseau clinico-biologique des MAT Centre National de Référence des MAT (PNMR) Tests phénotypiques pour les patients Inserm U770 Inserm U143 Inserm U143 Hémato bio Hôp. A. Béclère Hématol bio Hôp. A. Béclère Hémato bio Hôp. Lariboisière Tests génotypiques pour les patients Inserm U143/U770 Génétique Hôp. Hôtel-Dieu - CHU de Nantes

36 CNR-MAT : maillage territorial Nantes Rennes Caen Angers Tours Amiens Rouen Paris Lille Reims Dijon Strasbourg CNR-MAT Assistance Publique-Hôpitaux de Paris Saint Antoine Saint Louis Pitié Salpêtrière Tenon Antoine Béclère HEGP Bordeaux Limoges Toulouse Clermont- Ferrand Montpellier Lyon Marseille 19 Centres de Compétences La Réunion

37 Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT Service d Hématologie biologique S. Thouzeau-Benghezal, S. Savigny, S. Capdenat, Dr A. Stepanian, Pr A. Veyradier Etude phénotypique (ADAMTS13 activité FRETS-VWF73 et full-length VWF IgG anti-adamts13 titrage et inhibiteur) Inserm U770, Le Kremlin Bicêtre P. Legendre Dr C. Denis, Dr P. Lenting, Recherche fondamentale Modèle murin ADAMTS13 KO Service de génétique moléculaire Dr P. Boisseau, Pr S. Bezieau Etude génétique d ADAMTS13

38 Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT : activité Nombre de tests ADAMTS13 phénotypiques Soins courants 3000 Recherche clinique Labellisation CNR-MAT PNMR1 Filière MARIH PNMR Total sur 14 ans : environ tests phénotypiques -> recrutement national -> 1 à 3 séries d ADAMTS13 activité / semaine -> compte rendus spécialisés experts -> avis spécialisé (tel, ) dans 30% des cas

39 Cohorte du CNR-MAT de PTT lié à un déficit sévère d ADAMTS13 (~850 patients) Age de révélation :. adulte (93%). pédiatrique (7%) adultes Etiologie (tous âges):. Acquise (94%). Héréditaire (6%) PTT héréditaires PTT acquis enfants Etiologie (enfants):. Acquise (44%). Héréditaire (56%) Etiologie (adultes):. Acquise (98%). Héréditaire (2%) mais

40 Cohorte du CNR-MAT de PTT lié à un déficit sévère d ADAMTS13 révélé en contexte obstétrical (42 patientes) PTT héréditaires (20%) PTT acquis (80%) Moatti-Cohen et al, Blood 2012

41 Exploration biologique d ADAMTS13 I- Etapes pré-analytiques II- Méthodes biologiques. Activité d ADAMTS13. Antigène d ADAMTS13. Auto-anticorps anti-adamts13. Gène d ADAMTS13

42 Exploration biologique d ADAMTS13 I- Etapes pré-analytiques. Etude phénotypique (activité, antigène, recherche d auto-ac) - Plasma citraté ou serum - Si absence de ttt extemporané : congélation à -20 C ou -80 C - Si ttt sur un site extérieur, envoi dans la carboglace - Limites : communes à toutes les techniques. EDTA : inactivation d ADAMTS13 in vitro. Hémolyse : inactivation d ADAMTS13 in vitro. Etude génétique propres aux méthodes VWF full-length. Taux de VWF:Ag > 300 UI/dl propres aux méthodes fluorimétriques. Autofluorescence de certains plasma/serum?. Hyperbilirubinémie - Sang total EDTA ou citraté conservés à +4 C pdt 72 h ou -20 C - Consentement éclairé du patient

43 Exploration biologique d ADAMTS13 II- Méthodes biologiques : Activité d ADAMTS13 (1) Principe Dégradation d un substrat exogène (VWF full-length ou courts peptides de VWF) par l ADAMTS13 du plasma testé. Les produits de dégradation du VWF clivé par ADAMTS13 sont mesurés par des techniques : - électrophorétiques (multimères ou fragments) - immunologiques (CBA, VWF:Ag, Chr-VWF73) - d agrégation plaquettaire (VWF:RCo) - fluorimétriques (FRETS-VWF73) - de spectrométrie de masse (SELDI-TOF) Normes : % Objectif Détection des déficits fonctionnels sévères: activité d ADAMTS13 <10%

44 Exploration biologique d ADAMTS13 II- Méthodes biologiques : Activité d ADAMTS13 (2) Indications pour le diagnostic médical. Devant une suspicion de MAT en phase aiguë, confirmation ou infirmation du diagnostic de PTT (paramètre sensible et spécifique) - dans 95% des cas : non urgent! Délai préconisé < 10 jours. - dans 5% des cas : urgent car nécessité d ajustement thérapeutique rapide. confirmation diagnostique de PTT pour indication traitement immuno-modulateur si intolérance à la plasmathérapie ou flare-up. diagnostic d exclusion de PTT pour indication d eculizumab. Suivi biologique en rémission des patients ayant un(des) ATCD de poussées de PTT (paramètre ayant une valeur pronostique quant au risque de rechute)

45 Mesure de l activité d ADAMTS13 Méthodes électrophorétiques (VWF full-length) Multimères du VWF (SDS-agarose) Dilutions plasmatiques 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 Tp 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 Sujet normal Activité d ADAMTS13 100% Patient PTT Activité d ADAMTS13 <10% Furlan et al, NEJM 1998

46 Mesure de l activité d ADAMTS13 Méthodes électrophorétiques (VWF full-length) Fragments de dégradation du VWF (SDS-PAGE) 300 kda kda - SU - VWF clivage par ADAMTS13 Sujet normal Activité d ADAMTS13 100% Patient PTT Activité d ADAMTS13 <10% Tsai HM, NEJM 1998

47 Mesure de l activité d ADAMTS13 Méthodes immunologiques (VWF full-length) ELISA VWF:Ag Protéolyse Plasma rvwf WT + BaCl + 2 (substrat) ou Mesure du VWF:Ag résiduel par ELISA Acm anti-vwf N-term Patient PTT Acm anti-vwf C-term Sujet normal Obert et al, Thromb Haemost 1999

48 Mesure de l activité d ADAMTS13 Méthode Fluorimétrique (VWF-73) FRETS-VWF73 Kokame et al, Br J Haematol 2005

49 Mesure de l activité d ADAMTS13 Avantages et inconvénients des méthodes selon le substrat VWF utilisé Méthodes Avantages Inconvénients Méthodes VWF full-length Méthodes de référence, évaluées Sensibles à ~toutes les mutations d ADAMTS13 Longues (plusieurs jours) Interférence du VWF:Ag endogène du patient Non adaptables en kit commercial Méthodes VWF-73 Home-made Méthodes de référence, évaluées Rapides (1 journée) Pas d interférence du VWF:Ag endogène du patient Adaptables en kit commercial Interférence selon mode de révélation (autofluorescence spontanée) Non sensible à certaines mutations d ADAMTS13

50 Mesure de l activité d ADAMTS13 Corrélation des différentes méthodes Méthodes «home made» de référence entre elles (littérature ) (full-length vs full-length et full-length vs VWF-73) Littérature -> bonne corrélation inter-méthodes pour le diagnostic des déficits sévères mais discordances pour les déficits partiels et les valeurs normales Méthodes «home made» versus kits commerciaux récents. Etude multicentrique nationale en 2011 pilotée par le CNR-MAT (12 labos des Centres de Compétences du CNR-MAT, ~10 échantillons) -> nécessité d évaluer les kits commerciaux ADAMTS13 act. pour aider les Laboratoires des Centres de Compétences du CNR-MAT à choisir le meilleur kit si volonté de développer la technique sur site pour les urgences. Publication récente : Mackie et al, Thromb Haemost janvier 2013 Evaluation des Kits American Diagnostica (Fret-VWF86) et Technoclone (Chr-VWF73) versus méthode home made frets-vwf73 : 159 échantillons -> assez bonne corrélation inter-méthodes pour le diagnostic des déficits sévères mais discordances pour les déficits partiels et les valeurs normales

51 Evaluations menées par le laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT en EVALUATION DE 2 KITS COMMERCIAUX. Projet initial Evaluation en parallèle du kit Genprobe et du kit Technoclone mais rupture de stock du kit Technoclone pendant 6 mois. Finalement. Evaluation du kit Genprobe début Evaluation du kit Technoclone fin 2013-début NB : auto-financement des réactifs (pas de conflit d intérêt) PARTICIPATION AU STANDARD INTERNATIONAL. (NIBSC, United Kingdom) sous l égide du SSC VWF/ADAMTS13 de l ISTH. Très bons résultats

52 Evaluation du kit Genprobe pour la mesure de l activité d ADAMTS13 (1) Principe de la méthode Thouzeau S, Capdenat S, Stepanian A, Coppo P, Veyradier A. Thrombosis Haemostasis 2013 Dégradation d un substrat FRETS-VWF73 par l ADAMTS13 du plasma testé. Révélation par fluorimétrie. Calibrants et CQ du kit (bas : 16-26% / haut : 47-57%) CQ internes (PTT < 10%, pool 50%, pool 100%) Echantillons testés : n = PTT héréditaires (USS). 38 PTT acquis en poussée. 31 PTT acquis en rémission. 97 MAT diverses (SHU, sepsis, cancers, MAI et autres ). 30 sujets sains

53 ADAMTS13 activity (ATS-13 Activity Assay) 120 Limite de sensibilité : 15% Evaluation du kit Genprobe ADAMTS13 (2) 100 Seuil de relevance clinique : 10% échantillons <10% : 3 discordants (sur-estimés) échantillons entre 11 et 49% : 65 discordants dont 17 sous-estimés (<10%!) et 48 sur-estimés échantillons entre 50 et 100% : presque tous surestimés 20 Limite de sensibilité : 10% ADAMTS13 activity (In-house FRETS-VWF73) [51] [86] [72] [Number] of tested samples Total = 209

54 Evaluation du kit Genprobe pour la mesure de l activité d ADAMTS13 (3) Conclusion. Limites techniques : Seuil de détection (15%) trop élevé et > seuil de relevance clinique Calibrants non optimaux. Bonne sensibilité pour détecter les taux d ADAMTS13 < 10%. Défaut de spécificité -> sur-diagnostic de déficit sévère (!) dans 17 cas/65 (~1 cas / 4). Surestimation quasi-systématique des valeurs détectables -> problème de suivi des patients en rémission +++ (sous-diagnostic d un début de rechute biologique qui pourrait justifier une Injection préventive de rituximab?)

55 Evaluation du kit Technoclone pour la mesure de l activité d ADAMTS13 (1) Joly B, Stepanian A, Hajage D, Thouzeau S, Capdenat S, Coppo P, Veyradier A. Thrombosis Research, 2014 Principe de la méthode Dégradation d un substrat FRETS-VWF73 par l ADAMTS13 du plasma testé. Révélation par colorimétrie. Calibrants (n=6) et CQ du kit (n=2) CQ internes (PTT < 10%, pool 50%, pool 100%) Echantillons testés : n = PTT héréditaires (USS). 75 PTT acquis en poussée. 52 PTT acquis en rémission. 71 MAT diverses (SHU, sepsis, cancers, MAI et autres ). 30 sujets sains

56 ADAMTS13 activity (%) (Technozym ADAMTS13 activity ELISA) Limite de sensibilité : 3% Evaluation du kit Technoclone ADAMTS13 (2) Seuil de relevance clinique : 10% échantillons <10% : 11 discordants (sur-estimés) 68 échantillons entre 11 et 49% : 4 sous-estimés (<10%!) Autres plutôt sous-estimés échantillons entre 50 et 100% : Globalement sous-estimés Limite de sensibilité : 10% [94] [15] [53] [85] ADAMTS13 activity (%) (In-house FRETS-VWF73) [Number] of tested samples Total = 247

57 FRETS-VWF73 - Chr-VWF73 Graphe de Bland et Altman 149 échantillons dont l activité d ADAMTS13 est > 10% Evaluation du kit Technoclone ADAMTS13 (3) SD 41.7 Mean 6.6 Le test Chr-VWF73 (Technoclone) :. a tendance à sousestimer l act. A13. mesure des valeurs très dispersées de manière aléatoire SD (FRETS-VWF73 + Chr-VWF73)/2

58 Evaluation du kit Technoclone pour la mesure de l activité d ADAMTS13 (4) Conclusion. Seuil de détection (3%) bien adapté au seuil de relevance clinique (10%). Pistes d amélioration techniques : ajouter un calibrant (~80%) et des CQ. Pour la détection d une activité d ADAMTS13 < 10% - assez bonne concordance avec la méthode de référence FRETS-VWF73 - mais ~12% de résultats faux négatifs Attention à ne pas «manquer» le diagnostic biologique de PTT. Pour la mesure précise d une activité d ADAMTS13 >10% (entre 11 et 100%) - tendance à la sous-estimation systématique des valeurs détectables - grande variabilité des mesures, de manière aléatoire Attention à ne pas surestimer le risque de rechute et par conséquent, l indication d une injection préventive de rituximab lors du suivi des patients PTT en rémission clinique

59 Recommandations du CNR-MAT pour la mesure de l activité d ADAMTS13 à des fins de diagnostic médical Idéalement, la mesure de l activité d ADAMTS13 (technique et interprétation) effectuée dans le cadre de la documentation biologique d une suspicion de MAT :. relève d une activité biologique experte supragh dédiée aux maladies rares (plateforme biologique du CNR-MAT). repose en 1 ère intention sur la technique FRETS-VWF73. doit être contrôlée par une 2 ème méthode utilisant un substrat VWF full-length. systématiquement pour les patients pédiatriques. en cas de discordance avec la présentation clinique ou de pb analytique (autofluorescence par ex.) pour les patients adultes Le kit commercial Technoclone est le plus performant en Les utilisateurs doivent cependant en connaitre les limites et ne pas hésiter à avoir recours au labo ADAMTS13 du CNR-MAT en cas de doute ou de problème technique et/ou d interprétation.

60 Exploration biologique d ADAMTS13 II- Méthodes biologiques : Antigène d ADAMTS13. Principe ELISA utilisant des Anticorps polyclononaux ou monoclonaux anti-adamts13 Méthodes home made et kits commerciaux. Normes : ng/ml. Indication pour le diagnostic médical Caractérisation des déficits fonctionnels sévères héréditaires en ADAMTS13 (syndrome d Upshaw-Schulman) : Distinction déficit quantitatif / déficit qualitatif

61 Exploration biologique d ADAMTS13 II- Méthodes biologiques : Auto-anticorps anti-adamts13 (1). Titrage des IgG anti-adamts13. Principe ELISA utilisant de l ADAMTS13 recombinante sauvage et une révélation par des Anticorps anti-igg humaines. Méthodes home made et kits commerciaux.. Seuil de positivité: ~15 UI/ml. Sensibilité : le titre d IgG anti-adamts13 est positif dans ~75% des PTT acquis auto-immun en phase aiguë. Spécificité : le titre d IgG anti-adamts13 peut être discrètement positif chez un très faible pourcentage de sujets sains ayant une activité d ADAMTS13 normale. Indication pour le diagnostic médical Test de 1 ère intention pour la recherche d auto-ac anti-adamts13. Si et seulement si l activité d ADAMTS13 est inférieure à 10%, le tirage des IgG anti-adamts13 est indiqué afin d objectiver une cause auto-immune au déficit sévère en ADAMTS13 (PTT acquis autoimmun).

62 Exploration biologique d ADAMTS13 II- Méthodes biologiques : Auto-anticorps anti-adamts13 (2). Recherche d une activité inhibitrice circulante anti-adamts13. Principe Mesure de l activité ADAMTS13 résiduelle de mélanges, à différents ratios, de plasma testé + plasma témoin. Méthodes home made.. Seuil de positivité: variable selon les méthodes. Sensibilité : une AIC anti-adamts13 est retrouvée dans ~60% des PTT acquis auto-immun en phase aiguë. Spécificité : une AIC anti-adamts13 n est jamais détectée si l activité d ADAMTS13 est >10%. Indication pour le diagnostic médical Test de 2 ème intention pour la recherche d auto-ac anti-adamts13. Si et seulement si l activité d ADAMTS13 est inférieure à 10%, la recherche d une AIC anti-adamts13 est indiquée et permet :. si les IgG anti-adamts13 sont positives, d objectiver leur éventuel caractère inhibiteur (~80% des cas). si les IgG anti-adamts13 sont négatives, une IAC anti-adamts13 est rarement mise en évidence et pourrait alors être liée à la présence d IgA/IgM anti-adamts13

63 Exploration biologique d ADAMTS13 II- Méthodes biologiques : Analyse génétique d ADAMTS13 Principe Séquençage des 29 exons et des jonctions exon/intron du gène d ADAMTS13 Indication pour le diagnostic médical Confirmation du diagnostic de PTT héréditaire (Syndrome d Upshaw-Schulman) devant une histoire clinique et un phénotype biologique évocateurs : - poussées de PTT récurrentes depuis l enfance ou déclenchées par la grossesse - activité d ADAMTS13 (méthode full-length et méthode VWF-73) < 10% de manière constante (en poussée de PTT en en rémission) avec IgG anti-adamts13 négatives Sensibilité : des mutations bi-alléliques du gène d ADAMTS13 sont retrouvées dans ~99% des USS Spécificité : les mutations bi-alléliques du gène d ADAMTS13 ont une spécificité de 100% dans le diagnostic de l USS

64 Arbre décisionnel simplifié pour l investigation d ADAMTS13 à visée diagnostique dans le PTT : recommandation CNR-MAT ADAMTS13 activité non effondrée.. PTT en poussée effondrée IgG / inhibiteur anti-adamts13 positif négatif ADAMTS13 activité PTT en rémission non effondrée effondrée (+ auto-ac anti-adamts13 nég.) Séquençage du gène d ADAMTS13 pas de mutation mutations Diagnostic PTT acquis PTT héréditaire?

65 Cas clinique N 1 Un nouveau-né (fille) présentant un ictère développe à J2 de vie, une thrombopénie à 20 giga/l associé à une anémie à 10 g/dl avec 3% de schizocytes. Il existe une protéinurie modérée sans insuffisance rénale. Il n y a aucun contexte clinique particulier. Les parents sont cousins germains et il y a dans la fratrie de 4 enfants, un frère décédé à quelques jours de vie dans un tableau de défaillance multiviscérale inexpliqué (il y 10 ans) et 2 sœurs bien portantes. Vous suspectez une MAT.

66 Cas clinique N 1 1. Quels examens biologiques complémentaires demandez-vous? Réticulocytes : Coombs érythrocytaire : négatif LDH : Biliribine non conjuguée : Haptoglobine : effondrée ADAMTS13 activité : effondrée <10% Fractions de la voie alterne du complément : C3, C4, CH50 : normaux

67 Cas clinique N 1 2. Quel diagnostic suspectez-vous? Pourquoi?. PTT héréditaire (syndrome d Upshaw-Schulman). Tableau clinique évocateur : ictère néonatal + anémie hémolytique mécanique + thrombopénie profonde sans contexte clinique particulier. Consanguinité parentale. Probable atteinte d un frère ainé décédé (ischémie systémique). Forme acquise de PTT rarissime voire inexistante à cet âge

68 Cas clinique N 1 3. Quels examens biologiques complémentaires demandez-vous? Selon quel protocole?. Contrôle de l effondrement de l activité d ADAMTS13 sur un 2 ème prélèvement (Attention : préciser au clinicien de prélever avant l initiation d une plasmathérapie). Titrage des IgG anti-adamts13 : négatives. Eventuellement : dosage de l Antigène d ADAMTS13. Séquençage du gène d ADAMTS13 : mutations bi-alléliques du gène d ADAMTS13. Enquête familiale : phénotypique et génotypique

69 Cas clinique N 2 Une femme de 38 ans arrive aux urgences d un centre hospitalier pour asthénie, dyspnée, pétéchies diffuses et céphalées. La NFS plaquettes retrouve une anémie à 8 g/dl avec 3% de schizocytes et une thrombopénie à 15 giga/l. La fonction rénale est normale. L examen neurologique retrouve une discrète confusion mentale. Les beta-hcg sont négatives. La patiente n a pas d ATCD médical particulier et elle ne prend pas de traitement. On retrouve la notion d un lupus chez sa sœur.

70 Cas clinique N 2 2. Quel diagnostic suspectez-vous? Quels examens biologiques complémentaires demandez-vous?. PTT acquis auto-immun idiopathique. Bilan d hémolyse : réticulocytes, coombs érythrocytaire, LDH, bilirubine C/NC, Haptoglobine. Mesure de l activité d ADAMTS13 : <10%. Titrage des IgG anti-adamts13 : 100 UI/ml

71 Cas clinique N 2 3. La patiente est traitée par plasmathérapie (EP) pendant 10 jours et entre en rémission clinique. Le contrôle de l activité d ADAMTS13 à 6 mois en rémission montre une activité toujours effondrée <10%. Qu en pensez-vous? Quelle attitude préconisez-vous?. Risque de rechute important dans les 2 premières années. Surveillance biologique systématique tous les 3 mois (en dehors de tout événement clinique intercurrent). Si l activité d ADAMTS13 reste <10% à 1 an, discuter avec les cliniciens du CNR-MAT l indication d un traitement préventif des rechutes par Rituximab

72 Bibliographie A. Veyradier, M. Wolf, A. Stepanian, P. Coppo. ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur Willebrand. EMC (Elsevier Masson SAS, Paris), Biologie Médicale, A, 2011 A.Veyradier, P. Coppo. ADAMTS13, von Willebrand factor specific cleaving protease. Med Sci (Paris) 2011 Dec; 27(12):