1 ère année 2016/2017 AM Davila et C Tinsley COURS DE MICROBIOLOGIE GENERALE

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1 1 ère année 2016/2017 AM Davila et C Tinsley COURS DE MICROBIOLOGIE GENERALE 1

2 Cours et TP de microbiologie à l emploi du temps Date Demie promo A Demie promo B 7 sept Cours 1 (structures) 7 sept Cours 2 (génétique) 8 sept Cours 1 (structures) 8 sept Cours 2 (génétique) 9 sept TP 1 12 sept TP 2 13 sept TP 3 14 sept TP 1 15 sept TP 2 16 sept TP 3 3 oct Cours 3 (métabolisme) Cours 3 (métabolisme) 2

3 Salles de TP

4 Le cours est dans le «bloc Sciences de la Vie et du Milieu». Pré requis : bases solides en biologie générale, biochimie, génétique et biologie moléculaire. Contenu et objectifs des cours. Bases qui seront utilisées (en ce qui concerne la première année) dans d autres parties du tronc commun et dans les modules à choix. Spécificités structurales des bactéries, génétique, métabolisme et physiologie. Eléments importants pour les interactions avec les autres composants de la biosphère (biotiques et abiotiques) dans les activités humaines Contenus et objectifs des TP Mettre en pratique les principales méthodes expérimentales utilisées en microbiologie Identification d une souche bactérienne, étude de sa morphologie et de son métabolisme Etude d un transfert génétique entre bactéries (conjugaison) 4

5 INTRODUCTION 5

6 Classification des organismes cellulaires ANIMAUX EUCARYOTES Domaine de la microbiologie PLANTES PROTISTES algues protozoaires champignons PROCARYOTES EUBACTERIES ARCHAE Virus Acellulaire 6

7 Ordres de magnitude liaison C-C distance inter-bases de l'adn porine d'e. coli glucose diamètre de l'hélix d'adn nucléosome membrane cellulaire RNA pol. LacI procaryote λ ribosome poxvirus Plasmodium mérozoïte Paramecium E. coli erythrocyte S. cerevisiae m liaison C-C 1,5 x distance inter-bases de l'adn 3,4 x glucose 6 x pore du porine d'e. coli 1 x 10-9 diamètre de l'hélix d'adn 2,4 x 10-9 LacI 4 x 10-9 bactériophage λ 6 x 10-9 epaisseur de la membrane cellulaire 8 x 10-9 nucléosome 1 x 10-8 RNA pol. Procaryote 1,2 x 10-8 ribosome 2 x 10-8 poxvirus 2 x 10-7 bacterium +/ Plasmodium mérozoïte 4 x 10-6 erythrocyte 7,5 x 10-6 yeast 1 x 10-5 Paramecium 1 x 10-4 oocyte humain 1 x

8 Grandes caractéristiques du monde Petite taille (inférieure à 0,1 mm) Conséquences sur : Invisibilité, possibilité de dissémination, capacité à donner des populations denses, techniques expérimentales Rapport surface/volume élevé, capacités d échange élevées Simplicité des structures cellulaires Diversité morphologique Diversité taxonomique microbien Diversité physiologique et métabolique 8

9 Méthodes expérimentales Largement illustrées dans les travaux pratiques Etude des individus isolés : difficile Observations microscopiques (photonique, électronique) Cytométrie en flux Etude après propagation : souvent nécessaire Techniques d isolement et de culture Etude sans culture préalable Techniques de manipulation aseptique 9

10 Grands types morphologiques 10

11 11

12 SPÉCIFICITÉS STRUCTURALES DES PROCARYOTES 12

13 Schéma type et simplifié d une cellule bactérienne 13

14 Contenu cytoplasmique Nucléoïde Plasmide(s) Ribosomes et polysomes (grande similarité avec ceux des eucaryotes) Matrice cytoplasmique : siège de la plupart des fonctions métaboliques Inclusions, granules de réserve Vésicules (rares) Cytosquelette Bacillus subtilis Microscopie électronique 14

15 Nucléoïde Un chromosome bactérien surenroulé associé à des protéines qui participent au maintien de la structure ARN et ARN polymérase Un modèle de la structure générale du chromosome bactérien. (A) Le chromosome circulaire d E. coli non replié. (B) L ADN replié en domaines chromosomiques par des associations protéine-adn. Les points noirs représentent des protéines qui interagissent entre elles et avec l ADN. Ce schéma montre six domaines mais E. coli en présente environ 50. (C) Chromosome compacté sous l effet du surenroulement et d interactions protéines-adn. 15

16 Granules de réserve a b Granulations de poly- -hydroxybutyrate chez Sphaerotilus natans. a : microscopie électronique b : microscopie optique Globules de soufre chez Thiomargarita namibiensis. 16

17 Inclusions Vésicules de gaz (hexagonales) chez la cyanobactérie Microscystis sp. Cellule en cours de division. Observation en microscopie électronique. Bactéries magnétotactiques de la mer Méditerranée observées au microscope électronique. La flèche indique une chaîne de magnétosomes. (D après Pradel) 17

18 Rôle des pigments Les pigments ont la capacité de passer d un état énergétique à un autre en changeant de couleur Production d énergie Stockage d énergie (molécule organique métabolite secondaire) Protection contre les rayonnements Evolution secondaire? Réponse au stress Antimicrobien Toxine Virulence Signalisation 18

19 Cytosquelette bactérien Le cytoplasme des bactéries contient des protéines homologues de l actine et de la tubuline des eucaryotes. Sous forme polymérisée, ces protéines participent au recrutement d autres protéines (enzymes). Exemples de rôles connus Homologue de la tubuline intervient lors de la division : polymérisation en anneau, au milieu de la cellule, sous la membrane cytoplasmique, recrutement des protéines qui assureront la formation du septum Homologues de l actine contrôle la forme de la bactérie : assure le positionnement d enzymes et de complexes membranaires intervenant dans la synthèse ou l hydrolyse de la paroi. Visualisation des filaments hélicoïdaux de l'actine bactérienne chez Bacillus subtilis (microscopie à fluorescence) R. Carballido-López 19

20 Schéma type et simplifié d une cellule bactérienne 20

21 Vs eucaryotes Particularités de la membrane cytoplasmique des procaryotes Structurales Pas de stérols (sauf chez les mycoplasmes) mais parfois des hopanoïdes Plus de protéines Fonctionnelles Respiration : déshydrogénases, coenzymes, ATPase Photosynthèse : pigments antennaires et centres réactionnels Synthèse d éléments de la paroi et des pili Assemblage et sécrétion de protéines membranaires et des exo-protéines Mobilité : structure basale des flagelles Réception de messages chimiques : chimiotaxie et régulation du métabolisme 21

22 Invaginations de la membrane Augmentation de la surface : activité respiratoire intense, photosynthèse Nitrosomonas : observations au microscope électronique A : cellules intactes ; B : cellules après lavage spécifique 22

23 Paroi bactérienne Enveloppe caractéristique de la cellule procaryote Paroi rigide qui confère à la cellule sa forme ; parfois qualifiée d exosquelette Fonctions Permet de résister à la forte pression osmotique interne (5 à 20 atm) Permet de résister aux agressions extérieures, chimiques, physiques, biologiques Barrière qui autorise les échanges avec l extérieur mais elle s oppose à la pénétration des plus grosses molécules 23

24 Paroi bactérienne Dans la paroi il existe un élément caractéristique et quasiment commun à tous les procaryotes : la muréine ou peptidoglycane Structure chimique de la muréine : motif de base N-acétylglucosamine Acide N-acétylmuramique Tétrapeptide 24

25 Peptidoglycane 25

26 Coloration de Gram Une bactérie à Gram positif Bacillus cereus Une bactérie à Gram négatif Serratia marcescens 26

27 Paroi type des bactéries à Gram positif 27

28 Acides teichoïques Peuvent représentés jusqu à 50% du poids de la paroi Acides teichoïques liés à la muréine Acides lipoteichoïques liés à la membrane cytoplasmique Déterminants antigéniques 28

29 Paroi type des bactéries à Gram négatif 29

30 Lipopolysaccharide LPS Lipide A : support de la toxicité de la molécule Polysaccharide : responsable de la spécificité antigénique Chaîne latérale O : permet le sérotypage (antigène O de paroi) 30

31 Espace périplasmique Significatif chez les bactéries à Gram négatif Contient des protéines différentes de celles du cytoplasme Ces protéines sont impliquées dans des fonctions aussi variées que Le transport de molécules, l efflux La dégradation de molécules La mobilité (présence de chimiorécepteurs) (Tamber et Hancock, 2003) 31

32 Principe coloration de Gram (D après M Naïtali) 32

33 Schéma type et simplifié d une cellule bactérienne 33

34 Couche S Extérieure à la paroi Bactéries à Gram + : pas de liaison covalente avec la muréine Bactéries à Gram - : couche S ancrée au LPS Formée d un ou deux types de polypeptides parfois additionné de glucide, arrangés en réseau d aspect cristallin carré, hexagonal ou oblique Membrane primitive? Fonctions Filtre pour les grosses molécules Fonctions anti-phagocytaires et anti-bactériophage Protection contre les variations de ph Adhésion 34

35 Glycocalix Couche généralement constituée de polysaccharides fibrillaires qui entoure la paroi Cohésion à la cellule bactérienne plus ou moins forte (capsule, slime, EPS) Capsule Acinetobacter sp en microscopie optique Colonie de Xanthomonas campestris (Jarober - NC State University Plant Pathology ) Cellules bactériennes produisant des EPS en microscopie électronique 35

36 Fonction du glycocalix Adhésion aux surfaces et formation de microcolonies Protection contre les agressions chimiques et biologiques comme la phagocytose (facteur de virulence) et la prédation (protozoaires) Utilisations possibles du glycocalix Spécificité sérologique (antigène K de capsule ou d enveloppe) utilisation diagnostique Utilisation des propriétés gélifiantes, émulsifiantes, lubrifiantes, etc 36

37 Pili commun (fimbriae) Flagelles et pili Flagelles 57_3.jpg Bactérie magnétotactique Dispositions courantes des flagelles 37

38 Composition chimique des Flagelles flagelles et pili Composés principalement d une protéine, la flagelline (sous unités répétées disposées en hélice) Pili Pili communs (fimbriae) et pili sexuels (transfert de matériel génétique entre deux bactéries) Essentiellement constitués de protéines, pilines et adhésines dans un arrangement spatial en cylindre droit 38

39 Propriétés et fonctions des flagelles et des pili Les flagelles Propriétés antigéniques antigène H flagellaire (immunité et sérotypage) Mobilité Les pili communs Propriétés antigéniques (immunité) Rôle dans l adhésion aux surfaces inertes ou aux cellules (formation de biofilm, facteur de virulence) Peuvent être les éléments moteurs de la locomotion par glissade ou par saccade Eléments terminaux de systèmes de sécrétion (virulence) Peuvent présenter des récepteurs (bactériophages) 39

40 Locomotion chez les bactéries Possible pour certaines bactéries sous conditions particulières d environnement. Les mécanismes moléculaires ne sont pas tous élucidés surtout en ce qui concerne la mobilité en milieu solide Milieu liquide Nage par propulsion flagellaire (swimming) Hydrostation (par l intermédiaire de vésicules de gaz) Milieu solide Swarming (essaimage) Mvt coordonné Différentiation Flagelles + surfactant ou eau Twitching (saccade) Mvt coordonné Pili de type IV + eau ou surfactant Gliding (glissement) Mobilité aventureuse Propulsion par macromolécules et/ou mvt structures externes Harshey, 2003 Sliding ( étalement) Expansion de la colonie + réduction tension de surface (surfactants, etc) 40

41 Locomotion par propulsion flagellaire Attachement du flagelle chez une bactérie à Gram négatif (wikipedia) Prescot et al. Microbiology Nécessite un gradient de protons Tactismes : chimiotactisme, aérotactisme, phototactisme, magnétotactisme, etc 41

42 Biofilm Communautés de microorganismes, possédant une structure tridimensionnelle et englobées d'une matrice extracellulaire (polysaccharide, ADN, protéines... ) constituées d'une ou, plus souvent, de plusieurs espèce(s) augmentation d adhésion aux surfaces augmentation de la résistance aux attaques chimiques ou physiques Communication et développement coordonné des organismes constituants Développement d'un biofilm JM Ghigo, Institut Pasteur, Paris 42

43 Biofilm et quorum sensing Communauté multicellulaire complexe L organisation dépend d un processus de communication inter-cellulaire- Quorum sensing Les auto-inducteurs : petites molécules qui à forte concentration sont à l origine d une réponse concertée (coopération) dans la communauté Faible densité bactérienne Auto-inducteurs en faible concentration perdus par diffusion Forte densité bactérienne Auto-inducteur rencontre un récepteur Signal transmis à la machinerie transcriptionnelle D après C Tinsley 43

44 Spore bactérienne Observation au microscope photonique C est une forme de résistance qui résiste à Température (minimum 10 min à 80 C) Antibiotiques Désinfectants Dessication Structure de la spore bactérienne Endospore de Bacillus subtilis observée au microscope électronique Rayonnements (UV, X) 44

45 Sporulation JF Perrin 2010 Germination possible si les conditions environnementales le permettent 45

46 Structures bactériennes peuvent être Obligatoires pour leur survie et leur développement Nécessaires pour leur survie ou protection Eléments d interaction avec l environnement biotique ou inerte Utiles du point de vue taxonomique ou diagnostic (ex Gram, sérotypage) Autres applications dans les activités humaines Peintures avec des bactéries Huffington post 8 avril

47 (D après M Naïtali) 47

48 Principaux ouvrages utilisés Physiologie de la cellule bactérienne : une approche moléculaire FC Neidhardt, JL Ingraham, M Schaechter Cours de microbiologie générale A Meyer, J Deiana, A Bernard Molecular genetics of bacteria L Snyder et W Champness Microbial ecology R Atlas et R Bartha Bacterial metabolism G Gottschalk Microbiology webbed out T Paustian et U Wisconsin Microbes-edu.org 48