Transport mitochondrial des acides gras

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1 Transport mitochondrial des acides gras Carina Prip-Buus Institut Cochin Département Endocrinologie, Métabolisme et Cancer Paris U1016 UMR 8104

2 Quelques rappels sur les acides gras Longueur de la chaîne carbonée - 4 à 6 carbones : acides gras à chaîne courte (AGCC) - 8 à 10 carbones : acides gras à chaîne moyenne (AGCM) - 12 à 20 carbones : acides gras à chaîne longue (AGCL) - Plus de 20 carbones : acides gras à très longue chaîne (AGTLC) Degré d insaturation - Saturés - Monoinsaturés - Polyinsaturés : ω3, ω6 et ω9 Degré d hydrophobicité Mécanismes de transport à travers une membrane

3 Devenir métabolique des acides gras à chaîne longue (AGCL) ALB Microsomes ω-oxydation Elongation Estérification Acylation des protéines FABPc ACS ACBP Mitochondrie β-oxydation Energie Cétogenèse β-oxydation AGCM Peroxysomes Acide gras ALB : albumine FABPc : cytosolic fatty acid binding protein ACS : acyl-coa synthétase ACBP : acyl-coa binding protein

4 Devenir métabolique des AGCL ALB ACBP Microsomes ω-oxydation Elongation Estérification Acylation des protéines FABPc ACBP ACS β-oxydation Energie Cétogenèse Mitochondrie β-oxydation AGCM ACBP Peroxysomes Acide gras ALB : albumine FABPc : cytosolic fatty acid binding protein ACS : acyl-coa synthétase ACBP : acyl-coa binding protein

5 Transport mitochondrial des acides gras et flux d oxydation AGCL AGCC AGCM Oléate Butyrate MME MMI Matrice ACS Système de transport Production de corps cétoniques N J N J N = Nourri; J = à Jeun AGCC : acide gras à chaîne courte AGCM : acide gras à chaîne moyenne AGCL : acide gras à chaîne longue ß-oxydation

6 Le système «carnitine palmitoyltransférase» AGCL CoASH Membrane externe ACS Espace intermembranaire Membrane interne Matrice Carnitine CPT2 Acylcarnitine Carnitineacylcarnitine translocase CoASH ß-oxydation

7 Contrôle coordonné de l oxydation du glucose et des AGCL Glucose AGCL VLDL Glucose AGCL TG Glycolyse Glucokinase G-6-P AGCL FAS Malonyl-CoA Acétyl-CoA Acétyl-CoA Carboxylase Lipogenèse Pyruvate Acétyl-CoA ATP Citrate Lyase Corps cétoniques TCA Citrate CO 2 Citrate

8 Contrôle coordonné de l oxydation du glucose et des AGCL Glucose AGCL VLDL Glucose AGCL TG Glycolyse Glucokinase G-6-P - AGCL FAS Malonyl-CoA Acétyl-CoA Acétyl-CoA Carboxylase Lipogenèse Pyruvate Acétyl-CoA Citrate TCA CO 2 Citrate ATP Citrate Lyase McGarry et al J.Clin.Inv. 60, 265

9 Le malonyl-coa est l inhibiteur physiologique de la Concentration de malonyl-coa Substrats 0 µm 10 µm 20 µm % de la valeur contrôle [1-14 C] Palmitate [1-14 C] Palmitoyl-CoA [1-14 C] Palmitoyl-carnitine

10 Conséquences métaboliques de l expression d une A insensible au malonyl-coa (mt) Akkaoui et al Biochem J AGCL AGCL AGCL FAS G20 + Ins (Glucose 20 mm + Insuline 10 nm) + Acétyl-CoA G20 + Ins G5 100 nmoles/2h/mg de prot 5 pi/cellule mt X ACC Culture primaire d hépatocytes de rat Oxydation Oléate [1-14C] - Malonyl-CoA Oxydation des AGCL? Coloration des lipides neutres (Red Oil) G5 G20 + Ins * C C Colloque «Meetochondrie» ß-gal mt ß-gal ß-gal mt Aussois 10 Mai 2010

11 Le système «carnitine palmitoyltransférase» AGCL CoASH Membrane externe ACS Espace intermembranaire Membrane interne Matrice Carnitine CPT2 Acylcarnitine Carnitineacylcarnitine translocase CoASH ß-oxydation

12 La carnitine-acylcarnitine translocase : CACT - Famille des transporteurs mitochondriaux (ornithine, ADP/ATP, phosphate, citrate, UCP ) - Identifié et caractérisé dans les années 1970 Ramsay and Tubbs, FEBS Lett 1975 Pande, PNAS Cloné en 1997 Rat Indiveri et al, Biochem J 1997 Homme Huizing et al, Am J Hum Genet Chromosome 3p21.31 chez l Homme Viggiano et al, Cytogenet Cell Genet Séquence spécifique de liaison de la carnitine R(A,S)(V,F)PANAA(T,C)F De Lucas et al, Arch Microbiol Décifit chez l homme

13 Les CPT mitochondriales A Isoforme hépatique (L-) B Isoforme musculaire (M-) CPT2 Gène (Homme) 11q13.1-q13.5 Britton et al. (1995) 22q13.31-q13.32 Yamazaki et al. (1996) 1p32 Gellera et al. (1994) Protéine 773 aa - 88 kda 772 aa - 82 kda 63% identité 658 aa - 82 kda Tissus Ubiquitaire sauf muscle squelettique Muscle squelettique Cœur Ubiquitaire Déficits humains OUI??? OUI Sensibilité au malonyl-coa OUI et Variable OUI mais non variable NON IC 50 Malonyl-CoA 1-30 µm 0,03 µm

14 Régulation post-traductionnelle de l activité de la 1- Modifications à court terme de la concentration de malonyl-coa inactive Glucagon/AMPc Insuline - + PKA AMPK P AMPK AMPKK + Adiponectine Leptine active + + P Malonyl-CoA ACC ACC active inactive ACC : acétyl-coa carboxylase PKA : protéine kinase A AMPK : AMP-kinase AMPKK : AMP-kinase kinase

15 Régulation post-traductionnelle de l activité de la 2- Changements à long terme de la sensibilité de la A au malonyl-coa Naissance, allaitement Jeûne Diabète Oxydation des AGCL Sensibilité de la A au malonyl-coa Sevrage Réalimentation Obésité Oxydation des AGCL Sensibilité de la A au malonyl-coa Forte sensibilité au malonyl-coa Glucagon - + Insuline Faible sensibilité au malonyl-coa Foetus Cultures d hépatocytes Prip-Buus et al Biochem. J. 269, 409 Nouveau-né 24h

16 La A mitochondriale de rat Domaine N-terminal Domaine catalytique C-terminal (homologie de séquence) TM1 TM CPT2 mat A CPT2 773 C-ter Difficultés rencontrées pour l étude de la A N-ter TM1 1 TM2 147 Cytosol M.M.E. Espace intermembranaire Fraser et al Biochem.J. 323, 711 Activité non sensible aux protéases Sensibilité au malonyl-coa sensible aux protéases Pb : isolement des mitochondries intramyofibrillaires Inactivation par les détergents Dosage activité CPT2 Activité A versus activité CPT2? Nécessité d utiliser des mitochondries intactes TM : segment transmembranaire

17 Evolution historique du système CPT Avant Après 1997 Acylcarnitine M. ext. Acylcarnitine Acylcarnitine Acylcarnitine CATo M. int. CACT CACT CACT Matrice CATi CPT2 CPT2 CoASH CoASH CoASH Fritz and Yue, J Lipid Res 1963 Kopec and Fritz, J Biol Chem 1973 Murthy and Pande, PNAS 1987 Fraser et al, Biochem J 1997

18 Analyse structure-fonction de la A Expression hétérologue dans S. cerevisiae de mutants A ou de protéines CPT chimériques Coll. J.P. Bonnefont,Hôpital des Enfants Malades-Necker, Paris Site de liaison du malonyl-coa Déficits humains en A Malonyl-CoA? Domaine catalytique C-terminal Déterminants structuraux et fonctionnels Prip-Buus et al. Mol Genet Metab 2001 Gobin et al. Hum Genet 2002 Gobin et al. JBC Cytosol Rat A MME TM1 TM2 Domaine N-terminal Espace intermembranaire Interactions N/C intramoléculaires Degré de sensibilité au malonyl-coa Faye et al. Biochem J 2005 Importation mitochondriale Maintient le domaine catalytique C-terminal dans une conformation sensible au malonyl-coa Pas de liaison du malonyl-coa Cohen et al. JBC 1998 Cohen et al. JBC 2001 Pan et al. JBC 2002

19 Questions qui restent encore sans réponse Malonyl-CoA - Acylcarnitine Cytosol MME Site de liaison du malonyl-coa des s? Espace intermembranaire Acylcarnitine Différence de sensibilité au malonyl-coa entre A et B? MMI CPT2 CACT CoASH

20 Questions qui restent encore sans réponse Malonyl-CoA - Acylcarnitine Cytosol MME Transport des acylcarnitines à travers la M. externe? MME Acylcarnitine Porine Acylcarnitine Acylcarnitine Faye et al, J Biol Chem 2007 Espace intermembranaire Acylcarnitine Dynamique membranaire du système «CPT»? Sites de contact 5-10 % surface mitochondriale MMI CPT2 CACT Cytosol MME 60 % 40 % ACS X Porine Sensibilité au malonyl-coa CoASH MMI CPT2 Fraser and Zammit, Biochem J 1998

21 Attention aux «CPTs-like» non mitochondriales Réticulum endoplasmique M. Plasmique Organe ou biopsie congelé CPT2 25% 65% CoASH Activité CPT globale = Activité cellulaire + CPT2 Activité CPT + malonyl-coa = Activité CPT2 globale CPT2 10% Carnitine CPT2 CACT Acylcarnitine Activité CPT + détergent = Activité CPT2 globale Péroxysomes FOIE CoASH Mitochondrie

22 Importance du contrôle du transport mitochondrial des AGCL Acyl-carnitine Site de liaison du malonyl-coa Molécules pharmacologiques Cytosol Pool cytosolique des acyl-coa à chaîne longue MME TM1 TM2 Désordres métaboliques Diabète Obésité Flux d oxydation mitochondrial Signalisation cellulaire Expression des gènes Trafic membranaire Apoptose Sécrétion d insuline Prise alimentaire

23 Remerciements Denis McGarry Jean-Paul Bonnefont Laure Thuillier Stéphanie Gobin Les membres du groupe «CPT» Isabelle Cohen Audrey Faye Marie Akkaoui Julia Monsenego Carole Henique Abdelhak Mansouri Catherine Esnous Véronique Lenoir

24 Transport des acides gras à travers la membrane plasmique Diffusion simple Transport facilité Acide gras ALB Bidirectionnel FABPpm ALB ALB-R FATP ALB CD36 FABPc FABPc ACS ACBP Unidirectionnel couplé à une activation ACS ACBP ALB : albumine FABPc : cytosolic fatty acid binding protein ACS : acyl-coa synthétase ACBP : acyl-coa binding protein ALB-R : récepteur à l albumine FABPpm : fatty acid binding protein