De la validation de méthodes bioanalytiques à l analyse d échantillons réels. Annick Ménétrey Tacheron CCCTA 18 septembre 2008

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1 De la validation de méthodes bioanalytiques à l analyse d échantillons réels Annick Ménétrey Tacheron CCCTA 18 septembre Debiopharm Group 2007

2 Bioanalyse Objectif: déterminer la concentration d une ou de plusieurs molécules dans un échantillon biologique (ou milieu biologique: plasma, sang, urine...) Dans le cas de l industrie pharmaceutique, lors des études précliniques et cliniques validation de la méthode bioanalytique 2 aspects principaux en fonction de guidelines application à l analyse en routine 2

3 La validation: Guidelines Paramètres et critères d acceptation réglementés Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation, May 2001, US Department of Health and Human Services, FDA ICH Q2A, Terminology and Definition, 1995 ICH Q2B, Methodology, : Nouvelle réunion FDA sur la bioanalyse Clarifications et nouvelles exigences pour la validation des méthodes bioanalytiques et pour leur application en routine Référence: Viswanathan C.T., The AAPS Journal,

4 Validation, paramètres fondamentaux «Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation, May 2001» Exactitude («accuracy») Précision Sensibilité («low limit of quantification, LLOQ») Courbe de Calibration («linearity») Spécificité («selectivity») Rendement («recovery») Stabilité 4

5 Validation, paramètres fondamentaux «Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation, May 2001» Exactitude («accuracy») Précision Sensibilité («low limit of quantification, LLOQ») Courbe de Calibration («linearity») Spécificité («selectivity») Rendement («recovery») Stabilité d échantillons enrichis («spiked») 5

6 Validation: principes «Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation, May 2001» L effet de chaque étape depuis le prélèvement de la matrice jusqu à la fin de l analyse doit être investigué. S a m p le N a m e : C 1 0 '0 0 0 S a m p le T y p e: S ta n d a rd S a m p le ID : A c q u isitio n D a te : 0 9 /2 5 / :1 3 :5 8 C a l. L e v e l: O p e ra to r: D a ta P a th : I:\D o k u m en t\a \A _ P L A S M A L E V E L \6 _ L C -M S \1 3 \0 4 C o m m e n ts : R u n T im e (m in ): S o ftw a re R e v is io n : 1.0 V ia l: 1 7 In j V o l (u L ): S a m p V o l: S a m p W t: IS T D A m t: D il. F a c to r: E x p M e th od : C :\X c a lib u r\m eth o d s\e m d \D eb io _ C yc lo C a p c i+ sim 2 P ro c M e th o d : C :\X c a lib u r\m e th o d s\p ro c e ssin g \D E B IO _ c y c lo s p o rin _ p m d IT : M e th o d C o m p o ne nt: D e b io E R T : R T : S M : 5 G S W : V W : R T R : n o 8 0 ID : N e a re s t 70 M P H : S M : 5 50 V D : y es 4 0 E P W : C P : n o 2 0 IS T D : R el a tiv e A bu n da n c e C yc lo s p o r in _ C R T : T i m e ( m i n) N L : E 5 m / z = F : + c A P C I S IM m s [ , ] M S 17 IT : M e th o d IS T D : C y c lo s p o rin _ C E R T : R T : S M : 5 G S W : V W : R T R : n o 8 0 ID : N ea re s t 70 M P H : S M : 5 50 V D : y e s 4 0 E P W : C P : n o 2 0 R T : R el a tiv e A bu n da n c e T m e ( m n ) N L : E 4 m / z = F : + c A P C I S IM m s [ , ] M S 17 6

7 Exemple: EB101 Procédure de préparation du plasma Procédure standardisée de préparation du plasma pour la détermination du EB101: Incubation at 4 C (transport), Incubation at 37 C (± 1 C) for 30 ±15 minutes, Analyses Centrifugation 7

8 Problèmes bioanalytiques Les paramètres de validation ne sont pas toujours suffisants pour obtenir des résultats exacts et précis dans les échantillons «réels» (incurred samples) 8

9 Problèmes bioanalytiques Standards QCs Echantillons 9 Pourquoi? présence de métabolites présence des excipients différence de liaison aux protéines différence de rendement d extraction inhomogénéité des échantillons adsorption aux tubes de prélèvement/stockage, libération de composés

10 Exemple: EB102 Influence d un métabolite Mise en évidence récente d un métabolite conjugué(s) du EB102 dans l urine des volontaires d une étude clinique de phase 1. Investigation en cours notamment sur la présence de ce conjugué dans le sang Conséquences pour la partie bioanalytique du projet et les précédents résultats PK? est-ce que ces conjugués, si ils sont présents dans le sang, interfèrent avec le dosage? 10

11 Exemple: EB102 Influence d un métabolite Instabilité du métabolite Stockage Préparation de l échantillon Analyse Concentration de EB102 «réelle» : 4.3 ng/ml Concentration de EB102 mesurée : 8.4 ng/ml 11

12 Exemple: EB102 Influence d un métabolite Instabilité du métabolite Stockage Préparation de l échantillon Concentration de EB102 «réelle» : 4.3 ng/ml Concentration de EB102 mesurée : 8.4 ng/ml Analyse Concentration de EB102 après 3 mois de stockage : 12.6 ng/ml 12

13 Exemple: EB102 Effet «matrice» sur le standard interne Dosage dans les échantillons urine, avec un standard interne de structure analogue Cumulated urine excretion after oral administration of EB102 EB102 (% dose) Etude 2 Etude Time [h] 13

14 Exemple: EB102 Effet «matrice» sur le standard interne Dosage dans les échantillons urine, avec un standard interne de structure analogue Cumulated urine excretion after oral administration of EB Etude 1 EB102 (% dose) Etude 2 patients ans volontaires ans Time [h] 14

15 Exemple: EB103 Différence de rendement d extraction (inhomogénéité) Dosage de EB103 dans les homogénats de faeces Total EB103 excretion in faeces [EB103] faeces (cumulated % of the dose) Time (h) % 15

16 Exemple: EB103 Différence de rendement d extraction (inhomogénéité) Détermination de EB103 dans les homogénats de faeces lors de l établissement du profil métabolique EB103 faeces (cumulated % of the dose) EB103 excretion in faeces Time (h) EB103faeces profil metabolique (cumulated % of the dose) % 16

17 Exemple: EB103 Différence de rendement d extraction (inhomogénéité) Standards QCs Extraction + Echantillons + 17

18 Exemple: EB103 Différence de rendement d extraction (inhomogénéité) Echantillons Extraction + Mesure de la radioactivité Mesure de la radioactivité 18

19 Nouvelles exigences, May 2006 La méthode doit être adaptée à l analyse des échantillons «réels» (incurred samples) 19

20 Conséquences 1. réanalyse d échantillons «réels» Démontrer la reproductibilité de la méthode avec des échantillons réels en effectuant des ré-analyses Les résultats font partie intégrantes de la validation, et doivent être ajoutés au rapport de validation 20

21 Conséquences 2. identification des métabolites Rechercher et identifier les métabolites très tôt dans le développement des médicaments Les validations peuvent être minimales lors du développement préclinique, mais toutes les exigences réglementaires bioanalytiques doivent être suivies lors des phases cliniques pour la mesure des métabolites. Problème d une méthode préliminaire! 21

22 Conséquences 3. Courbe de calibration et contrôles de qualité (QCs) Adapter la courbe de calibration et les contrôles de qualité aux concentrations des échantillons réels pour un intervalle de valeurs plus étroit, valider une nouvelle courbe de calibration et de nouveaux QCs stopper l analyse en cours si nécessaire 22

23 Conséquences 4. Effet matrice Afin de diminuer les effets «matrices», utiliser un isotope stable comme standard interne, et ce dès le début du développement. 23

24 Exemple: EB102 : Standards internes deutérés EB102 Lab value (ng/ml) Lab 1 Lab 2 Identity -30% +30% Lab new values True value (ng/ml) 24

25 Nouvelles exigences, May 2006 la concentration exacte du composé dans les échantillons réels reste difficile à certifier avec une seule méthode de dosage 25

26 Exemple: le EB '000 DEB-EB Batch 2J003C 10'000 pmol/l 1' E2 1 mg/kg IM RIA E2 30 mg/kg IM RIA E2 1 mg/kg IM LC-MS E2 30 mg/kg IM LC-MS days 26

27 Conclusions Le développement et la validation de méthodes bioanalytiques n est pas une tâche triviale. Une faille importante existe entre les résultats des méthodes validées selon les bonnes pratiques actuelles, dont le plan de validation se base sur l analyse d échantillons enrichis, et les résultats des échantillons réels, en raison de la nature complexe des matrices. 27