ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES MEMOIRE

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1 MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Julie PEREZ Pour l obtention du diplôme de l Ecole Pratique des Hautes Etudes RÉGULATION DES COMPLEXES MITOTIQUES APC/CDC20 ET APC/CDH1 DANS LES EXTRAITS D OVOCYTES DE XÉNOPES Soutenu le 16 décembre 2005 Devant le jury suivant : Pr. Yves BENYAMIN - Président Dr. Caroline MOYRET-LALLE - Examinatrice Dr. Anne MARCILHAC - Examinatrice Dr. Thierry LORCA - Examinateur Laboratoire : Directeur : Pr. Yves BENYAMIN EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) benyamin@univ-montp2.fr Motilité cellulaire - UMR 5539 Université Montpellier II Place Eugène Bataillon MONTPELLIER Cedex 05 Laboratoire : Directeur : Pr. Paul MANGEAT CNRS-CRBM FRE 2593 Tuteur : Dr. Thierry LORCA 1919 route de Mende lorca@crbm.cnrs-mop.fr MONTPELLIER Cedex 05 ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre RÉGULATION DES COMPLEXES MITOTIQUES APC/CDC20 ET APC/CDH1 DANS LES EXTRAITS D OVOCYTES DE XÉNOPES RÉSUMÉ L entrée en mitose et la progression de cette phase essentielle du cycle cellulaire des eucaryotes est sous le contrôle la protéine kinase Cdk1/Cycline B. Cette kinase hétérodimérique permet l activation du complexe EPHE Banque de Monographies SVT 1

2 APC/Cdc20 responsable de l ubiquitination de la Cycline B, signal nécessaire à sa dégradation par le protéasome 26S, et à l inactivation de la kinase Cdk1. À la transition métaphase-anaphase le complexe APC est activé par un homologue de la protéine Cdc20, la protéine Cdh1. Ce complexe APC/Cdh1 est responsable de l ubiquitination et de la dégradation de la protéine kinase Aurora-A en fin de mitose. Au cours de ce stage, je me suis intéressée à la proteine AIP (Aurora-A Interacting Protein) qui, chez l homme, interagie avec la protéine kinase Aurora-A et induit sa dégradation. De manière à mettre en évidence un lien possible entre la protéine AIP et le complexe APC/Cdh1, tous deux responsables de l instabilité de la protéine kinase Aurora-A, nous avons cloné l homologue de la protéine AIP chez le xénope. Cette protéine présente 43% d identité avec son homologue humain. Cette homologie étant surtout très forte dans la partie C-terminale de la protéine. Par la suite, nous avons sous-cloné l ADNc codant pour la protéine AIP dans de nombreux vecteurs d expression de manière à produire la protéine AIP sous différentes formes. L objectif ici était de produire AIP à partir d un système bacculovirus, bactérien et in vitro dans l extrait d œufs de xénope ou bien le lysat de réticulocytes. Nous avons rencontré à ce niveau un problème d expression majeur qui ne nous a pas permis d obtenir suffisamment de protéine AIP pour pouvoir étudier le rôle de AIP et son lien potentiel avec le complexe APC/Cdh1. Nous avons donc dans un deuxième temps initié une deuxième étude sur l étude de la protéine Cdc20 et sa localisation sur les kinétochores dans les conditions de mécanisme de surveillance de l intégrité du fuseau mitotique actif (ou «spindle checkpoint»). Nous avons ainsi dans un premier temps amélioré les conditions de traduction des ARNm exogènes dans les extraits d œufs de xénope arrêtés en métaphase de deuxième méiose. Ceci nous a permis de produire des quantités de protéines Cdc20 sauvage et mutantes supérieures ou égales au Cdc20 endogène.nous avons pu mettre en évidence un rôle critique de la concentration de la protéine Cdc20 dans l extrait et l œuf de xénope. Dans un deuxième temps, nous avons montré que l association à la protéine Mad2 ne semble pas requise pour la localisation de Cdc20 aux kinétochores et enfin dans un troisième temps nous avons pu déterminer que le domaine de liaison aux kinétochores pourrait se localiser au niveau des domaines WD40. MOTS CLÉS : APC : Anaphase Promoting Complex ; Cdh1 ; Cdc20 ; Mitose ; mécanisme de surveillance ; Cdk1-Cycline B. TABLE DES MATIÈRES LISTE DES ABRÉVIATIONS 1 INTRODUCTION 3 PARTIE 1 : LE CYCLE CELLULAIRE 3 I / Les phases du cycle cellulaire 3 II / Les contrôles du cycle cellulaire 6 II-1 / La régulation de la succession des phases du cycle cellulaire 6 II-2 / Les mécanismes de surveillance du cycle cellulaire 7 PARTIE 2 : LA MITOSE 9 I / Les acteurs de la progression mitotique 9 I-1 / Le MPF 9 I-2 / L APC 11 II / Le point de contrôle du fuseau mitotique 14 EPHE Banque de Monographies SVT 2

3 III/ Implication des kinases Aurora dans la mitose 16 III-1/ La famille des kinases mitotique Aurora 16 III-2/ La kinase Aurora-B 18 III-3/ La kinase Aurora-A 21 III-3-a/ Régulation de l expression d Aurora-A 21 III-3-b/ Régulation de l activité kinasique d Aurora-A 22 III-3-c/ Rôles exercés par Aurora-A lors du cycle cellulaire 25 PARTIE 3 : LA MATURATION MÉIOTIQUE DE L OVOCYTE DE XÉNOPE 27 I/ Méiose femelle 27 I-1/ Arrêt physiologique des œufs de xénopes 27 I-1-a/ Arrêt en prophase de première division méiotique 28 I-1-b/ Reprise de la première division de méiose et arrêt en métaphase de deuxième division méiotique 28 II/ Évènements biochimiques régulant la maturation méiotique 29 II-1/ Voie de signalisation conduisant à l activation du MPF 29 II-2/ MPF et transition méiose I/méiose II 30 III/ L arrêt CSF 31 III-1/ Mécanisme biochimique responsable de l arrêt CSF 31 III-2/ Maintenance de l arrêt CSF 32 IV/ Fécondation et sortie de CSF 33 SUJET DE RECHERCHE 34 MATÉRIELS ET MÉTHODES 36 PARTIE 1 : BIOLOGIE MOLÉCULAIRE 36 I/ Préparation d ADN complémentaire de xénope par RT-PCR 36 I-1/ Synthèse de l ADNc de xénope 36 I-2/ Amplification des ADNc de xénopes 36 II/ Sous clonage des ADNc amplifiés dans différents vecteurs 37 III/ mutagenèse dirigée 38 IV/ Séquençage 39 V/ Clonage et purification des vecteurs d expression 40 V-1/ Étape analytique 40 V-2/ Étape préparative 41 VI/ Transcription et traduction in vitro 41 VI-1/ Transcription in vitro 41 VI-2/ Traduction in vitro 42 EPHE Banque de Monographies SVT 3

4 PARTIE 2 : BIOCHIMIE 43 I/ Production des protéines d intérêts à partir d un système procaryote (E.coli) 43 I-1/ Transformation bactérienne 43 I-2/ Expression analytique des protéines 43 I-3/ Expression préparative des protéines 45 II/ Purification des protéines exprimées 45 II-1/ La fraction soluble 45 II-2/ La fraction insoluble 46 II-2-a/ Purification des corps d inclusion 46 II-2-b/ Électroélution de notre protéine présente dans les corps d inclusion 47 III/ Préparation d une phase Sépharose-CNBr-GST-AIP et purification des anticorps par affinité. 47 III-1/ Préparation d une phase d affinité Sépharose-CNBr-GST-AIP 47 III-2/ Purification par affinité des anticorps présents dans le sérum 48 IV/ Réalisation des extraits d ovocytes de xénope 49 IV-1/ Préparation de la ponte de xénope 49 IV-2/ Préparation d extraits CSF et interphasique d ovocytes de xénope 49 IV-3/ Test rapide de l extrait CSF 50 V/ Traduction dans les extraits d ovocytes de xénope 51 PARTIE 3 : BIOLOGIE CELLULAIRE 52 I/ Immunoprécipitation 52 II/ Le Western blot 53 III/ Activité histone H1 kinase 54 IV/ Immunofluorescence 55 V/ Cinétique de dégradation de la protéine cycline B endogène 56 RÉSULTATS 57 PARTIE 1 : Etude de la protéolyse de la protéine kinase Aurora-A par la protéine AIP 57 I/ Sous clonage de AIP dans différents vecteurs 58 II/ Production de la protéine AIP fusionnée à la GST 61 III/ Identification de la protéine produite et caractérisation des anticorps obtenus 62 IV/ Expression protéique en cellules d insectes 64 V/ Transcription et traduction de la protéine AIP in vitro 64 PARTIE 2 : Caractérisation de la protéine Cdc20 66 I/ Caractérisation du domaine de Cdc20 requit pour sa localisation aux kinétochores 66 I-1/ Présentation des différents domaines de la protéine Cdc20 sauvage et des protéines mutantes obtenues 66 I-2/ Production des ADNc et ARNm codant pour nos protéines mutantes. 67 I-3/ Localisation aux kinétochores et immunofluorescence. 70 EPHE Banque de Monographies SVT 4

5 II/ Evaluation de la capacité de chaque mutant à activer l APC en mesurant la protéolyse de la Cycline B 76 III/ Détermination de l effet dominant négatif des mutants Cdc20 sur leur capacité à inhiber la dégradation de la Cycline B 83 DISCUSSION ET PERSPECTIVES 86 I/ Discussion 86 II/ Perspectives 96 BIBLIOGRAPHIE 98 ANNEXES ANNEXE 1 : Composition des milieux, colorants, tampons et solution utilisées 107 ANNEXE 2 : Carte de restriction du vecteur pbks 110 ANNEXE 3 : Carte de restriction du vecteur pcs2 111 ANNEXE 4 : Carte de restriction du vecteur pgex 112 ANNEXE 5 : Carte de restriction du vecteur pmal 113 ANNEXE 6 : Séquence primaire de l ADNc codant pour Cdc20 de Xenopus Laevis 114 ANNEXE 7 : Sites de restriction uniques et absents de la séquence primaire de Cdc20 de Xenopus Laevis 115 ANNEXE 8 : Mise en évidence des mutations ponctuelles du mutant M-NP de Cdc ANNEXE 9 : Séquence primaire de l ADNc codant pour AIP de Xenopus Laevis 117 ANNEXE 10 : Sites de restriction uniques et absents de la séquence primaire de Cdc20 de Xenopus Laevis 118 LISTE DES ABREVIATION EPHE Banque de Monographies SVT 5

6 ADN ADNc AIP APC ARN ATP BSA CIP Cdc Cdk CNBr CPM CSF DAPI dntp ddntp DTT DO GST GVBD HCG HRP IPTG l M MBP MPF MTOC PAGE PCR SDS TM TEMED u ub WT Acide DésoxyriboNucléique Acide DésoxyriboNucléique complémentaire Aurora Interacting Protein Anaphase Promoting Complexe Acide RiboNucléique Adénosine TriPhosphate Bovine Serum Albumine Calf Intestinal Phosphatase Cell Division Cycle Cyclin dependent kinase Bromure de cyanogène Coup Par Minute CytoStatic Factor Di Amino Phenyl Indol désoxyribonucléosides Triphosphate didésoxyribonucléosides Triphosphate DiThioTréitol Densité Optique Déplété / Délété Glutathion S-Transferase Germinal Vesicle BreakDown Hormon Chorionic Gonatropin Horse Rodish Peroxidase Isopropyl b D-thiogalactopyranoside Longeur d onde mol/l Maltose Binding Protein M-Promotor Factor Microtubule Organizing Center PolyAcrylamide Gel Electrophoresis Polymerase Chain Reaction Sodium Dodécyl Sulfate Temperature Melting Tétramethyl-Ethylènediamine unité Ubiquitine Wild Type EPHE Banque de Monographies SVT 6

7 INTRODUCTION PARTIE 1 : LE CYCLE CELLULAIRE «Tous les êtres vivants sont formés d un ensemble d unités de construction de même type, les cellules.». C est au milieu du XIX iéme siècle, que le docteur Théodore Schwann ( ) propose cette notion : La cellule comme constituant de base de l organisme vivant. Le cycle cellulaire est le processus biologique fondamental permettant à une cellule de se reproduire à l identique. Chez les vertébrés, une seule cellule, la cellule mère, donnera après division, deux cellules filles parfaitement identiques entre elles et à la cellule dont-elles sont issues. Le patrimoine génétique est conservé entre la cellule mère et les cellules filles. Grâce à ce processus de division cellulaire, les cellules vont se multiplier, permettant à l embryon de se développer à partir d une cellule œuf unique, à l organisme de grandir et de régénérer les tissus endommagés pendant la vie adulte. Chez l être humain, une cellule œuf fertilisée va donner, par divisions successives, les milliards de cellules qui composent le corps humain à l âge adulte. À l extrême, certains êtres vivants microscopiques sont formés d une seule cellule (levures, amibes). Chez ces êtres unicellulaires, la division cellulaire permet la production d un organisme supplémentaire et identique au précédent. D une façon générale, les cellules se reproduisent en dupliquant leurs composants, en le répartissant équitablement en deux et en se divisant. Cette série d évènements doit être parfaitement EPHE Banque de Monographies SVT 7

8 régulée, afin d éviter l apparition de tumeur. Tout au long du cycle cellulaire, des points de contrôle permettent à la cellule de vérifier le bon déroulement des différentes étapes. Dans le cas ou un problème surviendrait, la cellule est capable d arrêter le cycle de division, et de le reprendre une fois le problème réglé. Si le problème est irréparable, La cellule induit ça propre mort afin de protéger l organisme. I / Les phases du cycle cellulaire Le cycle cellulaire est constitué principalement de deux phases : une phase de division, la mitose et une phase de croissance, l interphase, qui sépare deux divisions. Certaines cellules suivent le cycle cellulaire de façon continue, d autres, quittent le cycle temporairement pour entrer en phase G0. Cette phase correspond à une phase de quiescence pendant laquelle les cellules ne se divisent pas, c est sous l effet de signaux mitogènes qu elles entameront un nouveau cycle de division. Une partie des cellules quitte le cycle cellulaire définitivement et entre dans une voie apoptotique. Ces cellules ne participent pas à une nouvelle division, elles meurent. L interphase correspond à une période de croissance pendant laquelle les cellules vont se préparer à la mitose. Les cellules seront prêtes à entrer en mitose, lorsqu elles auront la taille et l équipement en organite favorable à la viabilité des cellules filles, et lorsque leur ADN et le centrosome seront répliqués. L interphase est subdivisée en trois phases : une phase de croissance initiale, la phase G1. Pendant laquelle la cellule croît et devient plus large, c est une phase de mise en route du mécanisme biochimique de réplication (synthèse d ARNs, de protéines et d enzymes). Lorsqu elle atteint une certaine taille, la cellule entre dans la phase suivante, la phase S. Cette phase correspond à une étape de synthèse, durant laquelle il y a réplication de l ADN. Enfin, une seconde phase de croissance, la phase G2. C est un intervalle entre la phase S et M, durant lequel il y a synthèse protéique dont une partie est nécessaire à l édification du fuseau cellulaire. Les phases G1 et G2 (G pour «GAP», intervalle) ont deux rôles essentiels : d une part préparer la cellule à entrer dans la phase suivante (phase S ou M), et d autre part vérifier le bon déroulement de la phase précédente. La mitose est une phase de division cellulaire. Au cours de l interphase, il y a eu duplication des chromosomes et du matériel cytoplasmique de la cellule, la mitose va désormais permettre la répartition en deux lots équitables du matériel génétique et la séparation en deux cellules fille. La mitose est classiquement découpée en cinq phases : La prophase, qui se caractérise d une part par la condensation chromosomique. Les deux chromatides de chaque chromosome sont alors bien définies, elles sont reliées au niveau des kinétochores centromériques. D autre part, le fuseau mitotique se met en place à l extérieur du noyau par séparation des deux centrosomes, aussi appelés centre organisateur des microtubules (MTOC pour microtubule organizing center). Les centrosomes se disposent autour du noyau de façon diamétralement opposé et forme les pôles du fuseau mitotique. À la prométaphase, l enveloppe nucléaire se rompt et disparaît permettant aux microtubules du fuseau de capturer les chromosomes au niveau de leurs kinétochores. Une fois l attachement bipolaire acquis, les chromosomes s alignent sur la plaque équatoriale du fuseau. La métaphase correspond au moment où la totalité des chromosomes sont alignés. Ils sont maintenus sous tension par les kinétochores et les microtubules associés attachés aux pôles opposés du fuseau. Lorsque EPHE Banque de Monographies SVT 8

9 tous les chromosomes sont parfaitement alignés, la cellule peut alors passer en anaphase. L anaphase correspond au moment où les chromatides sœurs se séparent, chacune migre vers un pôle du fuseau pour former deux lots identiques. En anaphase A, les microtubules kinétochoriens se dépolymérisent donc se raccourcissent et tractent les chromatides vers un pôle du fuseau. En anaphases B, les microtubules polaires s allongent par polymérisation et éloignent les deux pôles du fuseau. Enfin, la télophase correspond à la formation d une enveloppe nucléaire autour de chaque lot chromosomique, dans laquelle les chromatides se décondensent. Parallèlement, il y a invagination de la membrane plasmique et formation d un anneau contractile permettant la séparation des deux cellules filles, c est la cytokinèse. Une fois la division cellulaire achevée, le cycle cellulaire est bouclé, les cellules nouvellement formées peuvent entrer en phase G1 et démarrer un nouveau cycle de division ou entrer en phase G0 (pour revue, voir Meijer, 2003). La succession précise des phases G1, S, G2 et M, constitue un cycle de division. La durée de ce cycle varie considérablement en fonction des types cellulaires. Chez la plupart des cellules de mammifère, il dure entre10 et 30 heures. Plus particulièrement chez l homme, le cycle cellulaire dure environ 24 heures. Un temps défini est attribué à chaque phase du cycle, pour les cellules humaines, elles ont approximativement les durées suivantes : la phase la plus longue est la phase G1 qui dure 11 heures, ensuite la phase S : 8 heures, la phase G2 : 4 heures et la phase M qui ne dure qu une heure. La durée de chacune des phases du cycle est variable selon les espèces. Mais la phase la plus variable est la phase G1 qui peut durer de 6 à 12 heures, la phase M en revanche à une durée relativement stable. Paradoxalement, la phase M est la plus courte alors qu elle regroupe de nombreux évènements complexes. D autres cycles cellulaires sont beaucoup plus courts. C est le cas notamment des cycles embryonnaires précoces qui se produisent, chez certaines espèces animales (dont le xénope), immédiatement après la fécondation. Ces cycles, d une durée comprise entre 8 et 60 minutes selon les espèces, permettent de diviser rapidement la cellule œuf. Ils ne comportent pas de croissance cellulaire, pas de phase G1 ni G2, et se caractérisent par une succession rapide de phases S et M. II / Les contrôles du cycle cellulaire Chez les eucaryotes supérieurs, le cycle cellulaire se compose de quatre phases bien définies, qui se succèdent dans un ordre précis et invariable : phase G1, S, G2 et M. Il est indispensable pour le bon développement et la survie des organismes que les différentes phases du cycle cellulaire s enchaînent de façon coordonnée. Chaque phase ne devant démarrer que lorsque la précédente s est déroulée et terminée correctement. Des erreurs de coordinations du cycle cellulaire peuvent conduire à des altérations chromosomiques, comme la mutation ou perte d un chromosome, ou encore la distribution inéquitable des chromosomes entre les cellules fille, ce qui entraînerait des problèmes d aneuploïdie. Ces phénomènes sont souvent observés chez les cellules cancéreuses, d où l importance accordée au processus de contrôle du cycle cellulaire. Pour assurer, d une part, l enchaînement correct des quatre phases du cycle, et d autre part, l obtention de deux cellules filles parfaitement identiques, la cellule dispose de systèmes de régulation très pointilleux. La régulation de la succession des phases du cycle cellulaire s effectue essentiellement par l intervention de kinases cyclines-dépendantes (Cdk pour cyclin-dependent kinase) et de leurs cyclines associées. À cela s ajoute des mécanismes de surveillance du cycle, qui font intervenir d autres molécules pour inhiber ces Cdk et bloquer la progression du cycle lorsqu ils détectent une anomalie (étape précédente non terminée, EPHE Banque de Monographies SVT 9

10 réparation de l ADN nécessaire...). II-1 / La régulation de la succession des phases du cycle cellulaire Les trois lauréats du prix Nobel de Physiologie & Médecine en 2001 ont permis d éclaircir les mécanismes de contrôle cellulaire, en identifiant les molécules régulatrices du cycle cellulaire chez tous les organismes eucaryotes. Leland Hartwell fut récompensé pour avoir mit en évidence une classe de gènes impliquée spécifiquement dans le contrôle du cycle cellulaire : ces gènes sont appelés CDC (pour Cell Division Cycle). Son travail sur Saccarymyces cerevisiae, lui permis d identifier un gène CDC qui contrôle la première étape de progression vers la phase G1, c est le gène CDC28 aussi nommé gène «start». Paul Nurse identifia à son tour chez la levure un gène équivalent au gène «start», qui contrôle en revanche plusieurs phases du cycle cellulaire. En 1987, il découvre son équivalent humain, qu il nomme CDK1 pour Cyclin Dependant Kinase 1 (aussi connue sous le nom de Cdc2). Chez l homme, ce sont le produit des gènes CDK qui contrôlent les différents passages du cycle cellulaire, leur concentration ne varie pas au cours du cycle. C est Timothy Hunt qui au début des années 80, découvre les premières molécules de cycline. Les cyclines sont des protéines dont la concentration varie périodiquement au cours du cycle cellulaire, elles sont synthétisées et dégradées de façon cyclique, d où leur appellation. Les cyclines, comme les CDK ont été conservées chez toutes les espèces au cours de l évolution (pour revue, voir Morgan, 1997). Les kinases cyclines dépendantes : les CDK sont des sérine-thréonine kinases, dont l activité catalytique consiste à phosphoryler des protéines cibles intervenant dans les événements du cycle cellulaire ou dans la progression du cycle. Cependant pour être fonctionnelles ces CDK doivent s associer à une cycline. Les CDK constituent la sous-unité catalytique, et les cyclines la sous-unité régulatrice ou activatrice. Les cyclines sont nécessaires à l activation des CDK par formation d un complexe hétérodimérique et régulent leur activité enzymatique tout au long du cycle de division. Le cycle cellulaire est contrôlé par l intervention successive de six complexes CDK/Cycline différents. Chaque complexe rentre en jeu à des moments précis du cycle cellulaire et possède une fonction et des substrats bien définis (pour revue, voir Meijer, 2003). L ordre d intervention des CDK est déterminé par l ordre de transcription/traduction des cyclines. Les systèmes de contrôle du cycle cellulaire repose sur les phénomènes d activation et d inhibition des kinases cyclines-dépendantes. Ces CDKs peuvent être régulées à plusieurs niveaux : - Par l assemblage transitoire des complexes CDK/Cycline, comme décris précédemment. - Par des modifications post-traductionnelles, essentiellement des phosphorylations ou déphosphorylations, qui peuvent être activatrices ou inhibitrices. - Par association transitoire avec des protéines inhibitrices, les CKI (CDK Inhibitor), qui ne régulent que négativement. II-2 / Les mécanismes de surveillance du cycle cellulaire Les mécanismes de surveillance du cycle cellulaire appelés points de contrôle ou «checkpoints» permettent à la cellule de détecter des anomalies, et de provoquer l arrêt du cycle si des anomalies sont constatées. Ces points de contrôle sont des voies biochimiques qui régulent les transitions du cycle en réponse à des facteurs externes et internes. Tout au long de la progression du cycle cellulaire, il EPHE Banque de Monographies SVT 10

11 y a quatre points de contrôle majeurs, tous intervenant dans un même but : faire que les deux cellules fille héritent exactement du même génome à la fin de la division cellulaire. - Le point de restriction de la phase G1 : il intervient en fin de phase G1 et constitue un point de décision majeur du cycle cellulaire. À partir de là, la cellule entre définitivement ou n entre pas dans un nouveau cycle de division. Ce point de restriction contrôle la taille et l état physiologique de la cellule. Il surveille l environnement extérieur afin d y détecter des nutriments disponibles ou des facteurs de prolifération provenant d autres cellules ou de la matrice extra-cellulaire. Si les stimuli de croissance ne sont pas appropriés ou sont insuffisants, le cycle s arrête en attendant des conditions cellulaires adéquates ou lance un programme d apoptose. - Le point de contrôle du dommage à l ADN : il vérifie le bon état de l ADN tout au long des phases G1, S et G2. Lorsque des lésions de l ADN sont détectées, les transitions G1-S ou G2-M sont bloquées. Ces arrêts du cycle sont dus, d une part, à la dégradation de l activateur (CDC25A) des complexes CDK4/Cycline D et CDK2/Cycline E et A par la voie ATM-Chk2 (Busino et al., 2003) et d autre part, à l accumulation dans la cellule de p53 qui induit l expression de p21. La protéine p21 est une CKI qui inhibe les complexes CDK2/Cycline E et A et CDK1/Cycline B. - Le point de contrôle de la réplication de l ADN : il contrôle si la réplication de l ADN est correcte et totale. Si une anomalie de réplication est détectée, il bloque le cycle en phase S ou G2 et empêche l entrée en mitose. Il y a phosphorylation de la phosphatase activatrice (CDC25C) du complexe CDK1/Cycline B, laquelle entraîne sa séquestration dans le cytoplasme via son interaction avec la protéine (Forrest et Gabrielli, 2001). Le complexe reste alors inactif. Ce point de contrôle fait aussi intervenir la protéine p53, qui est un facteur de transcription de la protéine p21 et d enzymes de réparation de l ADN. - Le point de contrôle du fuseau mitotique : il surveille l attachement correct des chromosomes métaphasiques aux microtubules du fuseau. Ce point de contrôle ne s exerce qu un court instant de la métaphase jusqu à ce que tous les chromosomes soient alignés en plaque métaphasique (pour revue, voir Castro et al., 2003). Ce point de surveillance sera décrit plus en détail dans une seconde partie. PARTIE 2 : LA MITOSE I / Les acteurs de la progression mitotique I-1 / Le MPF Le MPF (M-phase Promoting Factor) est l inducteur d entrée en phase M (Méiose ou mitose). Ce facteur a été mis en évidence pour la première fois dans les ovocytes de Rana pipiens (Masui et Markert, 1971). Il est présent chez tous les eucaryotes (Doree, 1990). Le MPF correspond à un EPHE Banque de Monographies SVT 11

12 hétérodimère protéique, le complexe Cdk1/Cycline B (Labbé et al., 1989 ; Gautier et al., 1990). Le niveau intracellulaire de la sous-unité catalytique Cdk1 est constant durant le cycle cellulaire, cependant l activité enzymatique de cette kinase nécessite son association avec une cycline (une sous-unité régulatrice). Suivant la cycline à laquelle elle s associe, Cdk1 n aura pas la même fonction : ses substrats seront différents et elle ne contrôlera pas les mêmes phases de cycle. À partir de la phase S, il y asynthèse progressive de cycline B intracellulaire. Dès lors, la cycline B s accumule dans la cellule et s associe aux sous-unités CdK1 libres. Les cellules de mammifères contiennent au moins trois types de cycline B (Cinq pour le Xénope) : B1, B2 et B3. Ces cyclines B diffèrent par leur extrémité N-terminale. C est essentiellement la cycline B1 qui est impliquée dans le déclenchement dela transition G2/M. Bien avant le passage en mitose, il y a constitution d un stock de Cdk1/Cycline B1 qui reste dans un état inactif jusqu au moment de la mitose, c est le pré-mpf. Une fois formés, les complexes Cdk1/Cycline B1 sont régulés par différentes phosphorylations. D une part, ils subissent une phosphorylation activatrice de la thréonine 161 de la sous-unité catalytique, Cdk1. Cette phosphorylation activatrice est catalysée par la CAK (Cdk Activating Kinase), qui est en réalité le complexe Cdk7/Cycline H (Fesquet et al, 1993 ; Fisher and Morgan, 1994) stabilisé par un cofacteur, Mat1 (Devault et al., 1995). Cet état phosphorylé produit un changement conformationnel du site actif de Cdk1 (boucle T), lui permettant de se lier à ses substrats. Cependant, l activation par la CAK est contrée par les kinases Wee1 et Myt1, qui maintiennent les complexes nouvellement formés inactifs par phosphorylation inhibitrice de deux résidus de Cdk1, la thréonine 14 et la tyrosine 15. Ces résidus sont situés à proximité de la poche de fixation de l ATP, leur phosphorylation empêche la liaison de l ATP et inactive l enzyme. Les phosphorylations inhibitrices de Cdk1 s effectuent pendant les phases S et G2, au fur et à mesure que les complexes se forment. Les deux kinases ont beaucoup plus d affinité pour le complexe en formation que pour la sous-unité Cdk1 seule (Mueller et al., 1995). La kinase inhibitrice Wee1 est une protéine nucléaire (Heald et al., 1993) responsable de la phosphorylation de la tyrosine 15, le gène codant pour cette protéine a été découvert chez S.pombe. La kinase apparentée Myt1est une protéine membranaire localisée au niveau de l appareil de golgi (Liu et al., 1997), elle catalyse à la fois la phosphorylation inhibitrice de la thréonine 14 et de la tyrosine 15. Chez S.pombe et dans les cellules animales, le passage par cet état phosphorylé inhibiteur de Cdk1 est indispensable pour la régulation de l entrée en mitose. Dans les cellules animales, des résidus thréonine 14 et tyrosine 15 mutés en résidus non phosphorylables ne permettent pas une régulation correcte de l activation de Cdk1 (Krek and Nigg, 1991 ; Norbury et al., 1991). Le grand nombre de complexe inactif de Cdk1/Cycline B1 tri-phosphorylé (Phosphorylé en Thr 161, Thr 14 et Tyr 15) à partir de la phase S, constitue un stock de pré-mpf abondant prêt pour une activation brutale en fin de phase G2. Durant l interphase, le pré-mpf navigue entre le cytoplasme et le noyau, il est conduit par la cycline B. Au moment de la transition G2/M, les complexes inactifs s accumulent dans le noyau où ils sont activés par la phosphatase Cdc25C. L activité de Cdc25C s oppose à celle des kinases inhibitrices Wee1 et Myt1. Cdc25 induit la déphosphorylation des résidus thréonine 14 et tyrosine 15 de Cdk1 et déclenche ainsi l entrée en mitose. Le MPF, c est-à-dire le complexe Cdk1/Cycline B1 actif, est capable d activer son propre activateur. En phosphorylant la phosphatase Cdc25C, le MPF suit un processus d auto-amplification. D autre part, il phosphoryle aussi sa kinase inhibitrice wee1, afin de la rendre inactive. Le MPF crée ainsi un double rétrocontrôle positif, permettant d obtenir rapidement et de façon irréversible une grande quantité de complexes Cdk1/Cycline B actifs. EPHE Banque de Monographies SVT 12

13 Le MPF est l acteur moléculaire responsable de l entrée en phase M, ceci par phosphorylation de certains composants clés de la cellule. L entrée en mitose est marquée par de profonds remaniements cellulaires dus en partie à l activité du MPF. Parmi les protéines cibles du MPF, certaines interviennent au niveau du noyau : les condensines et les histones H1 et H3 sont impliquées dans la condensation des chromosomes, leur phosphorylation directe ou indirecte par le complexe Cdk1/Cycline B1 permet la condensation chromosomique en prophase. La phosphorylation des lamines nucléaires par le MPF provoque leur dépolymérisation et la rupture de l enveloppe nucléaire en prométaphase (Peter et al., 1990). D autres substrats du MPF interviennent au niveau cytoplasmique : ce sont essentiellement des protéines associées aux microtubules qui permettent l assemblage du fuseau mitotique. Le MPF agit sur des moteurs moléculaires de la famille des kinésines, dont Eg5, et d autres protéines liant les microtubules. La kinésine Eg5 est nécessaire pour la formation du fuseau bipolaire mitotique, car elle joue un rôle dans la séparation des centrosomes, sa phosphorylation par le MPF permet sa liaison aux microtubules (Blangy et al., 1995). Le complexe Cdk1/Cycline B1 participe également au réarrangement de l actine, en phosphorylant la caldesmone. La caldesmone est une protéine liant et stabilisant les filaments d actine, sa phosphorylation provoque sa dissociation des filaments d actine et contribue à l arrondissement de la cellule (Yamashiro et al., 1990). En outre, le MPF est impliqué indirectement dans la sortie de mitose. En effet, il est en partie responsable de l activation de l ubiquitine ligase APC (Anaphase Promoting Complexe), dont l activité est nécessaire à la dégradation ubiquitine dépendante de la sécurine et de la cycline B, ce qui permet la sortie de mitose (Kraft et al., 2003). Cependant, sa phosphorylation par le MPF ne suffit pas à activer l APC, nous verrons dans une autre partie que son activation nécessite aussi son association à une sous-unité activatrice. De nombreux autres éléments de la mitose sont de prés ou de loin liés à l activité du MPF. I-2 / L APC Le complexe promoteur de l anaphase, l APC, est un grand complexe multiprotéique composé chez les vertébrés d une douzaine de sous-unités. Il possède une activité ubiquitine ligase et permet le ciblage spécifique des protéines à ubiquitinyler. L ubiquitinylation à pour fonction principale d adresser les protéines cibles au protéasome 26S en vue de leur dégradation. La progression mitotique s effectue grâce à la dégradation ubiquitine dépendante de nombreuses protéines clées par le protéasome, comme des cyclines. L ajout de monomères d ubiquitine sur les protéines cibles résulte de la corrélation d activité de trois enzymes, dont l APC. La première étape de l ubiquitination protéique implique une enzyme d activation de l ubiquitine, l enzyme E1, qui lie une molécule d ubiquitine (8KDa) par la formation d un pont thiol ester entre une cystéine de son site d activation et un résidu glycine C-terminal de l ubiquitine. Cette activation de l ubiquitine nécessite de l énergie sous forme d ATP. L étape suivante correspond au transfert de l ubiquitine active sur une seconde enzyme, l enzyme de conjugaison E2. Celle-ci lie l ubiquitine par une liaison thioester de même type que la précédente et catalyse la liaison de l ubiquitine sur l enzyme E3. Le complexe APC est une E3 ligase. L APC transfère la molécule d ubiquitine sur un résidu lysine de la protéine substrat à laquelle il est associé spécifiquement. L enzyme E2 transporte les petites protéines d ubiquitine vers l APC les unes après les autres permettant la formation d une chaîne poly-ubiquitinée sur la protéine cible. Généralement, l APC catalyse la fixation de la nouvelle molécule d ubiquitine sur le résidu lysine 48 de l ubiquitine EPHE Banque de Monographies SVT 13

14 précédemment liée au substrat. Une fois poly-ubiquitinée les protéines mitotiques sont protéolysées spécifiquement par le protéasome 26S (Pour revue, voir Castro et al., 2005). Le protéasome 26S est un complexe multiprotéique formée de trois sous-unités : un protéasome 20S encadré par deux sous-unités 19S. Ce protéasome reconnaît et dégrade spécifiquement les substrats marqués par une chaîne poly-ubiquitinée formée d au moins quatre molécules d ubiquitine. Cette voie de protéolyse est ATP dépendante et elle est fonctionnelle tout au long du cycle cellulaire. La régulation de la dégradation cyclique des protéines responsable de la progression du cycle cellulaire ne semble pas s effectuer au niveau du protéasome mais plutôt au niveau de leur adressage au protéasome, c est-à-dire lors de l étape d ubiquitinylation. En effet, la régulation de la dégradation séquentielle des substrats mitotiques est réalisée par des phénomènes d activation et d inactivation du complexe APC au cours du cycle cellulaire. À l inverse des enzymes E1 et E2 qui ne sont pas régulées lors du cycle cellulaire, le complexe APC a une activité forte lors de la mitose et une activité basse pendant l interphase. Deux évènements contrôlent l activation de l APC : d une part, l état de phosphorylation de plusieurs de ses sous-unités (Kraft et al., 2003), et d autre part son association avec des protéines activatrices, Cdc20/Fizzy et Cdh1/Fizzy Related (Peters, 2002 ; Lorca et al., 1998). En début de mitose, le MPF participe à l activation du complexe APC en phosphorylant directement sa sous-unité Cdc27, laquelle est nécessaire pour son activation (Patra et Dunphy, 1998 ; Zachariae et Nasmyth, 1999 ; Kraft et al., 2003). De plus, cette phosphorylation augmente l affinité de Cdc20 pour l APC, permettant ainsi la formation de nombreux complexes APC/Cdc20 actifs. Sous forme complexée, la sous-unité activatrice confère à l APC, son activité ubiquitine ligase ainsi que sa spécificité de substrat. Les deux sous-unités activatrices de l APC interviennent successivement dans le cycle cellulaire. À partir de la métaphase, l APC est activé par la protéine Cdc20. Au cours de la mitose, Cdc20 est dégradée et remplacée par la protéine Cdh1 qui prend le relais et active à son tour le complexe jusqu en fin de phase G1 (Hagting et al., 2002). Les complexes APC/Cdc20 et APC/Cdh1 ont des substrats mitotiques différents, les protéines activatrices permettent à l APC d ubiquitinyler les protéines possédant dans leur séquence primaire un site de reconnaissance spécifique. Il existe deux types de domaines fonctionnels situés en partie N-terminale des protéines, la boîte de destruction D de motif oligopeptidique RxxL et la boîte de destruction KEN (K lysine ; E glutamate ; N aspartate) respectivement appelée «D- box» et «KEN-box». Le complexe APC/Cdc20 cible les protéines possédant un motif «D-box» uniquement, alors que le complexe APC/Cdh1 reconnaît les deux motifs (Pfleger et Kirschner, 2000 ; Hagting et al., 2002). Le complexe APC/Cdc20 a pour rôle principal, d assurer la séparation des chromatides sœurs et donc la transition métaphase/anaphase. En effet, l un des substrats du complexe APC/Cdc20 est la sécurine. Cette protéine mitotique est associée à une protéase de la famille des caspases, la séparase, et la maintient ainsi inactive. En fin de métaphase, le complexe APC/Cdc20 ubiquitinyle spécifiquement la sécurine provoquant sa dégradation protéolytique par le protéasome 26S. Dès lors, la séparase est libérée et s active par autoclivage, elle exerce son activité de protéolyse au niveau des complexes protéiques maintenant les deux chromatides sœurs associées : les cohésines. Les cohésines sont constituées de quatre sous-unités : deux grandes sous-unités de la famille des SMC (Structural Maintenance of Chromosomes), les protéines participant au maintien de la structure des chromosomes, SMC1 et SMC3 complexées aux protéines Scc1 et Scc3. La séparase clive la sous-unité Scc1 du complexe cohésine permettant la séparation EPHE Banque de Monographies SVT 14

15 des chromatides sœurs et le passage en anaphase. Par ailleurs, la kinase Plk1 (Polo-like Kinase 1) augmente la sensibilité de la sous-unité Scc1 pour la séparase, par phosphorylation de la sous-unité Scc1. Le MPF active la séparase par phosphorylation. La cycline B est le second substrat dont la dégradation est indispensable pour sortir de mitose. Elle possède également dans sa séquence primaire un motif «D-box». Le complexe Cdk1/Cycline B en activant l APC, contribueà sa propre inhibition puisque la destruction de la cycline B provoque une chute d activité du MPF. Cette inhibition du MPF est incontournable pour sortir de mitose, elle permet la disparition du fuseau mitotique à la fin de l anaphase B, le déclenchement de la cytokinèse et la transition vers la phase G1. Un des rôles du MPF est d empêcher la formation du complexe APC/Cdh1, par phosphorylation inhibitrice de la sous-unité Cdh1. Après dégradation de la cycline B, la phosphorylation inhibitrice de Cdh1 est levée et grâce à l action de la phosphatase Cdc14, Cdh1 peut se lier à l APC. À partir de l anaphase, il y a formation de complexes APC/Cdh1 actifs. Cdh1 permet à l APC d ubiquitinyler la protéine Cdc20 et d induire sa dégradation par le protéasome. La protéine Cdc20, possédant un motif «KEN-box», passe du statut d activateur à celui de substrat protéique du complexe APC. Le complexe APC/Cdh1 induit la destruction sélective de certains substrats permettant ainsi le passage en télophase et l achèvement de la mitose. Ce complexe est actif en fin de mitose et tout au long de la phase G1 jusqu au point de restriction. En fin de phase G1, Cdh1 est de nouveau phosphorylé par les complexes Cdk4-6/Cycline D et se sépare de l APC. L APC est alors inactivé et le restera durant toute l interphase, il sera réactivé lors de la mitose du cycle de division suivant. Les sous-unités activatrices de l APC, Cdc20 et Cdh1, sont soumises à différentes régulations et modulent ainsi l activité de l APC, qui n est pas continue dans le cycle cellulaire. Le point de surveillance du fuseau mitotique repose sur la régulation de l activité de APC/Cdc20 ; l APC/Cdh1 n est pas inhibé par le «spindle checkpoint». Avant que la transition vers l anaphase se réalise, la cellule doit s assurer que la totalité de ses chromosomes soit parfaitement alignée sur la plaque métaphasique. II / Le point de contrôle du fuseau mitotique Afin d éviter les problèmes d aneuploïdies (phénomène traduisant une répartition chromosomique inégale entre les cellules filles issues d un cycle de division), les cellules possèdent un mécanisme de surveillance spécifique de la transition Métaphase/Anaphase, qui est une étape ultime de la division cellulaire. L attachement correct des chromosomes au fuseau mitotique et leur alignement sur la plaque métaphasique sont des évènements indispensables au déclenchement de l anaphase. Le contrôle de ces évènements représente un point de surveillance important au cours de la mitose : le point de contrôle du fuseau mitotique ou «spindle checkpoint». Ce point de contrôle détecte si l alignement des chromosomes et l assemblage du fuseau ont été correctement accomplis lors de la métaphase. Dans le cas contraire, il permet à la cellule de retarder l entrée en anaphase jusqu à ce que ces conditions soient remplies. L analyse génétique de la levure et des études menées sur les cellules de vertébrés ont révélé que ce point de contrôle fait intervenir plusieurs protéines. Celles-ci agissent de concert pour bloquer l activité du complexe APC/Cdc20 et retarder ainsi la séparation des chromatides sœurs. Il a été identifié chez la levure six gènes comme étant impliqués dans ce contrôle mitotique : EPHE Banque de Monographies SVT 15

16 trois gènes Mad (Mitotic Arrest Deficient) Mad1, Mad2 et Mad3, deux gènes Bub (Budding Unhinibited by Benomyl) Bub1 et Bub3 et un gène Mps (Monopolar Spindle) Mps1 (Alexandru et al., 1999). Il a ensuite été identifié chez les vertébrés une protéine BubR1 (Bub Related kinase 1) homologue hybride de Mad3 et Bub1. L identification de nombreux homologues fonctionnels de ces gènes suggère que le mécanisme de surveillance de la transition Métaphase/Anaphase et ses composants, sont relativement bien conservés de la levure jusqu à l homme (Mao et al., 2003). Ces protéines actrices du «spindle checkpoint» sont cytoplasmiques lors de l interphase et s associent aux kinétochores en prophase et prométaphase lorsque les chromosomes sont bien condensés. Elles se dissocient ensuite des kinétochores qui se sont associés de façon stable au fuseau mitotique. Chez les eucaryotes supérieurs, ce point de contrôle intervient à la transition Métaphase/Anaphase de chaque cycle cellulaire, alors que chez la levure il est actif seulement dans le cas d une anomalie (Basu et al., 1999 ; Gorbsky et al., 1998 ; Taylor and McKeon, 1997). Chaque kinétochore non correctement attaché au fuseau envoie un signal inhibiteur bloquant l activation du complexe APC/Cdc20. Le complexe multiprotéique formé dés l entrée en mitose sur les kinétochores libres est constitué des protéines kinases Bub1, Bub3, BubR1 et Mps1 avec les protéines Mad1 et Mad2. La sérine/thréonine kinase Mps1 participe à l assemblage complexe du checkpoint du fuseau, sa présence aux kinétochores est essentielle au bon fonctionnement du contrôle (Abrieu et al., 2001). Mps1 interagie avec la kinase Bub1, toutes deux sont mutuellement dépendantes et forme un complexe avec la protéine CENP-E, une molécule moteur de la famille des kinésines, l assemblage de ce complexe sur les kinétochores est indispensable pour les étapes ultérieures (Stucke et al., 2002 ; Vigneron et al., 2004). La protéine CENP-E s associe aux chromosomes lorsque l enveloppe nucléaire se rompt, et est régulée par phosphorylations par les kinases Mps1 et BubR1 avec lesquelles elle interagie. La kinase Bub1 régule par phosphorylation la protéine Mad1 qui va recruter et activer la protéine Mad2. Les protéines Mad2 et Bub1 participent à la détection de l occupation des kinétochores, alors que les protéines Bub3 et BubR1 sont plutôt sensibles à la tension exercée par le fuseau de microtubule sur les kinétochores. Il a été défini plusieurs modes d inhibition de l activité ubiquitine ligase du complexe APC/Cdc20 par le spindle checkpoint, dans le cas où les kinétochores ne sont pas liés aux microtubules du fuseau en prométaphase et métaphase. Une première possibilité est que Mad2 lie les kinétochores libres via la protéine Mad1, ce qui entraîne l assemblage d une forme active tétramèrique de Mad2 (Fang et al., 1998). C est sous cette forme que Mad2 peut bloquer l activité ubiquitine ligase de L APC. Mad2 tétramérique lie le complexe APC/Cdc20 via la sous-unité activatrice Cdc20 et l inhibe, empêchant la destruction de la sécurine et la séparation prématurée des chromatides sœurs (Fang et al., 1998). Une fois tous les chromosomes accrochés de façon bipolaire aux microtubules kinétochoriens et correctement alignés sur la plaque équatoriale, la forme active de Mad2 cesse d être produite, le complexe de surveillance se retire des kinétochores et Mad2 libère Cdc20 permettant l action du complexe APC/Cdc20 et le passage en anaphase. Plus récemment, Sudakin et al. ont mis en évidence un facteurinhibiteur d APC/Cdc20. Ce facteur est un complexe composé de BubR1, Bub1, Mad2 et Cdc20, qu ils ont appelé «le complexe du contrôle mitotique» ou «MCC» (Mitotic Checkpoint Complex). Le MCC inhibe APC/Cdc20 trois mille fois plus que la protéine Mad2, suggérant que ce complexe peut réguler l APC au cours de la mitose (Sudakin et al., 2001). III/ Implication des kinases Aurora dans la mitose EPHE Banque de Monographies SVT 16

17 III-1/ La famille des kinases mitotique Aurora De nombreuses protéines kinases sont essentielles au déroulement du cycle cellulaire. Parmi celle-ci, les protéines de la famille Aurora sont des sérine/thréonine kinases qui ont des rôles importants en mitose. Ces protéines kinases participent à la régulation centrosomale et aux fonctions microtubulaires, en assurant la ségrégation correcte des chromosomes et l achèvement efficace de la cytokinèse. Des protéines kinases appartenant à cette famille ont été identifiées chez de nombreuses espèces (de la levure à l Homme). En raison du grand nombre d appellations attribuées à chacune de ces kinases, il aété proposé une nomenclature (Nigg, 2001), les classant selon leurs degrés d homologies de séquence et de fonction, sous les noms d Aurora-A, -B et -C. Le nom attribué à cette famille correspond au nom du premier gène cloné chez la drosophile D.melanogaster, lequel entraîne par mutation la formation de fuseaux de divisions monopolaires évoquant des figures d aurore boréale (Glover et al., 1995). Chez la levure, il n a été identifié qu une seule protéine kinase membre de cette famille (Ipl1 chez S.cerevisiae et Ark1 chez S.pombe) qui correspond à Aurora-B, alors qu il en existe deux chez le xénope, le nématode et la drosophile : Aurora-A et-b et trois chez les mammifères : Aurora-A, -B et -C. La structure primaire des protéines Aurora est très divergente dans la partie N-terminale et très conservée en partie C-terminale. La partie N-terminale est un domaine riche en résidus basiques, elle est de longueur et de séquence très variable selon le membre de la famille. Des études ont permis d admettre que c est la partie amino-terminale des protéines Aurora qui détermine leur localisation, elle correspond à un domaine de localisation (Giet et Prigent, 2001 ; Bolton et al., 2002). Chaque kinase possède un lieu de localisation cellulaire spécifique aux étapes de la mitose. Lors de la mitose, la protéine Aurora-A est présente au niveau des centrosomes et des pôles du fuseau mitotique. Aurora-B se localise aux kinétochores jusqu à la transition métaphase/anaphase, puis sur la partie centrale du fuseau. L expression de la protéine Aurora-C est restreinte aux cellules germinales mâles, dans lesquelles elle a une localisation centrosomale en anaphase uniquement (Nigg, 2001). La partie C-terminale des kinases Aurora est un domaine catalytique d une longueur d environ 250 acides aminés. Il est organisé en douze sous-domaines ce qui est une caractéristique fréquente des sérine/thréonine kinases (Hanks et al., 1988). Ce domaine est commun aux trois Auroras, il est marqué par une boucle d activation de motif «xrxtxcgtx» spécifique des kinases Aurora, et par un motif de dégradation de type «D-box» (RxxL), dont la fonctionnalité a été mise en évidence par Aurora-A (Arlot-Bonnemains et al., 2001 ; Castro et al., 2002a, b). Au cours du cycle cellulaire, les kinases Aurora subissent une forte régulation d expression : pour chacun des trois gènes, l abondance au niveau de l ARNm comme au niveau protéique, est faible en phase G1, augmente fortement lors de la phase G2 pour atteindre un pic en mitose et décroître rapidement après celle-ci. D autre part, l activité kinase des protéines Aurora est fortement régulée par phosphorylation après leur liaison à des partenaires spécifiques. Elles sont éliminées par protéolyse à la fin de chaque mitose (Lindon et Pines, 2004). Chez les mammifères, chacune des trois kinases assure des fonctions mitotiques différentes, illustrées par des localisations distinctes, mais toutes en relation directe avec le processus de ségrégation des chromosomes. Un défaut d activité des kinases Aurora perturbe la division cellulaire et entraîne des problèmes de polyploïdie. Un intérêt grandissant est porté à ces protéines depuis que leur surexpression a été mise en évidence dans de nombreux cancers et corrélée à une instabilité chromosomique. Les travaux portés sur Aurora-C sont plus restreints, cette protéine étant spécifique d un seul type cellulaire. De plus chez notre modèle d étude, le xénope, aucun homologue d Aurora-C n a été EPHE Banque de Monographies SVT 17

18 recensé. Ainsi, la présentation suivante portera uniquement sur Aurora-A et -B. III-2/ La kinase Aurora-B La kinase Aurora-B joue un rôle important lors de nombreuses étapes mitotiques, une altération de sa fonction entraîne des problèmes de polyploïdisation cellulaire. Notamment la formation de cellules aneuploïdes résultant d une mauvaise orientation des chromosomes en métaphase, et la formation de cellules polynucléées dénonçant un défaut de cytokinèse. Aurora-B fait partie des protéines passagères et constitue la sous-unité catalytique d un complexe de trois protéines essentiel à la mitose : le trio Aurora-B, INCENP et survivine (Bolton et al., 2002). Sous forme complexées les protéines passagères se contrôlent mutuellement : elles régulent leur localisation cellulaire et l activité kinasique d Aurora-B. La protéine Aurora-B par sa région N-terminale interagie avec la protéine INCENP qui lui confère sa localisation et la phosphoryle. Une fois phosphorylé, INCENP stimule l activité kinasique d Aurora-B, lançant ainsi une boucle de rétrocontrôle positif entre les deux partenaires (Bishop et Schumacher, 2002). En outre, la survivine contribue aussi à l activation de la kinase Aurora-B et permet une localisation correcte de la protéine (Bolton et al., 2002 ; Chen et al., 2003). Ces protéines passagères sont localisées au niveau de l hétérochromatine centromérique en fin de phase G2 puis sur les centromères en métaphase. Au moment de la ségrégation des chromatides sœurs, elles sont transférées sur les microtubules du fuseau central, où elles passent la fin de mitose. Elles doivent leur nom de «protéines passagères du chromosome» à ce phénomène de relocalisation effectué lors de la transition Métaphase/Anaphase, durant laquelle elles transitent du centromère sur les microtubules. L hétérotrimère protéique permet à la protéine kinase Aurora-B d exercer diverses fonctions tout au long de la mitose. Récemment, Gassmann et al. ont mis en évidence une nouvelle protéine passagère, la boréaline, nécessaire à la stabilité du fuseau bipolaire. La boréaline serait un quatrième partenaire du complexe Aurora-B, INCENP et Survivine, auquel elle peut s associer (Gassman et al., 2004). En début de mitose, Aurora-B participe à la structure des chromosomes ; en phosphorylant l histone H3 sur la sérine 10 (Petersen et Hagan, 2003) et sur la sérine 28 (Goto et al., 2002), Aurora-B permet la condensation de la chromatine. De plus, elle permet au moment de laprophase le recrutement des complexes condensine sur les chromatides sœurs induisant leur condensation (Petersen et Hagan, 2003), tout en provoquant le relargage des complexes cohésine, lesquels permettaient dès la phase S la cohésion des chromatides sœurs, seuls les complexes de la région centromérique seront épargnés jusqu à la transition Métaphase/Anaphase. Lors de la prométaphase et de la métaphase, Aurora-B joue un rôle important dans la biorientation des chromosomes. Pour assurer une répartition égale des chromosomes entre les deux cellules fille, la ségrégation des chromatides sœurs doit avoir lieu uniquement lorsque les chromosomes sont attachés aux microtubules de façon amphitélique. C est-à-dire lorsque les chromosomes sont accrochés de chaque côté par liaison de microtubule au niveau de leurs kinétochores : un kinétochore attaché par un (levures) ou plusieurs (mammifères) microtubules émanant d un même pôle du fuseau mitotique, et l autre kinétochore par des microtubules issus du pôle opposé. Cet attachement chromosomique lors de la métaphase exerce une tension de part et d autre du chromosome, apprêtant la séparation et la tractation des chromatides sœurs vers les pôles opposés du fuseau, on parle de bi-orientation des chromosomes. La tension subie par les chromosomes entraîne leur alignement sur la plaque métaphasique et stabilise EPHE Banque de Monographies SVT 18

19 l attachement kinétochores/microtubules, de plus cette tension initie la séparation des chromatides sœurs. Les microtubules ne captent pas directement les chromosomes de façon amphitélique, ils passent par un attachement monotélique, où un seul kinétochore est relié à un pôle du fuseau, et souvent par un attachement syntélique, où les microtubules d un même pôle lient les deux kinétochores d un même chromosome. Ce dernier mode d attachement ne permet pas une tension au niveau du chromosome et donc le passage en anaphase. Cette liaison kinétochores/microtubules n est pas stable, la kinase Aurora-B, présente dans la région centromérique, interviendrait alors pour désassembler les attaches kinétochores/microtubules et favoriser la bi-orientation des chromosomes. Des études sur la levure ont révélé que Ipl1, l homologue d Aurora-B, favorise un «turn-over» d interaction kinétochores/microtubules jusqu à ce que le chromosome soit bi-orienté. Ipl1 effectue une correction de l attachement par auto-phophorylation et phosphorylation d autres protéines présentes aux kinétochores comme l homologue d INCENP, Slil5. Ces phosphorylations contribueraient à déstabiliser l attachement kinétochores/microtubules (Kang et al., 2001 ; Cheeseman et al., 2002). Lorsque les kinétochores sont sous tension, ils sont éloignés de la région centromèrique et ne subissent plus l effet déstabilisant d Aurora-B. En régulant l attachement bipolaire des kinétochores, Aurora-B participe d une certaine façon au point de contrôle du fuseau mitotique marquant l étape transitive en fin de métaphase. Cependant, ce n est pas le seul rôle connu d Aurora-B dans le point de contrôle du fuseau mitotique, la kinase est aussi impliquée dans l établissement du «spindle checkpoint». Comme nous l avons décrit précédemment, chez les eucaryotes, le point de contrôle du fuseau se compose de toute une série de protéines : Mad1, Mad2, Mad3, Bub1, Bub3, Mps1, BubR1 et CENP-E. Ces protéines localisent aux kinétochores les unes après les autres, chacune permettant le recrutement de la suivante, pour former un complexe multiprotéique dont la fonction est d inhiber l activité ubiquitine ligase du complexe APC/Cdc20 et bloquer ainsi la transition Métaphase/Anaphase. Le «spindle checkpoint» est levé lorsque les chromosomes sont correctement alignés sur la plaque équatoriale, c est-à-dire lorsqu ils sont attachés de façon amphitélique et sous tension aux microtubules du fuseau. Chez le xénope, la kinase Aurora-B ou plus précisément le complexe Aurora-B/INCENP/Survivine permet la mise en place du «spindle checkpoint» (Kallio et al., 2002). Les travaux réalisés sur les extraits d ovocyte de xénope ont permis de montrer que Aurora-B contrôle la localisation kinétochorienne de toutes les protéines du checkpoint analysées, alors que la localisation centromérique d Aurora-B n est pas affectée par l absence d une quelconque autre protéine du checkpoint. Aurora-B, associé à INCENP et Survivine apparaît être à la base de la cascade protéique du «spindle checkpoint» (Vigneron et al., 2004). L expression et la fonctionnalité de cette kinase est indispensable pendant la mitose, Aurora-B est le plus haut médiateur connu du point de contrôle du fuseau mitotique assurant une répartition chromosomique en deux lots parfaitement identiques. Lorsque les chromatides se séparent, les protéines passagères du chromosome dont Aurora-B, jusqu à là présente dans la région centromérique, transitent le long des microtubules du fuseaucentral, pour se placer àégale distance des pôles opposés du fuseau, dans la zone de formation du «mid-body» (L anneau contractile, à partir duquel il y a scission des deux cellules filles), où elles resteront jusqu à la fin de mitose. Aurora-B participe à l étape finale de la division qui conduit à l individualisation des deux cellules filles, la cytokinèse, en étant impliquée dans la régulation de la dynamique du fuseau central (Severson et Bowerman, 2002). En effet, plusieurs travaux ont montré que l inhibition d Aurora-B entraîne une altération du processus de cytokinèse : les cellules ne sont pas séparées, expliquant ainsi les EPHE Banque de Monographies SVT 19

20 phénomènes de polynucléation. La formation et la constriction de l anneau contractile en fin de mitose, nécessite le recrutement au niveau du fuseau central en Anaphase de plusieurs protéines, dont des moteurs moléculaires comme les kinésines et les myosines. Le mécanisme de séparation cellulaire est dépendant du cytosquelette d actine, le système actine-myosine est en partie responsable de la cytokinèse. Des études ont montré l implication d Aurora-B dans la régulation de ces moteurs moléculaires ; Chez C.elegans, Aurora- B semble nécessaire au recrutement de la protéine ZEN4, homologue de la protéine de mammifère MKLP1 («Mammalian Kinesin-Like Protein 1»), avec laquelle elle interagit (Severson et al., 2000). Aurora-B a pour substrat la myosine II, qu elle phosphoryle sur le résidu sérine 19 de sa sous-unité MRLC («myosin II Regulatory Light Chain») (Murata-hori et al., 2000). Cette phosphorylation est nécessaire au bon fonctionnement de la cytokinèse (Iwasaki et al., 2001). En résumé, la kinase Aurora-B, grâce à sa nature de protéine passagère, intervient à différents niveaux de la mitose, de la prophase (au niveau des chromosomes) jusqu en télophase (au niveau du cytosquelette de la cellule). Tout au long de la mitose, Aurora-B a pour rôle de contrôler la ploïdie cellulaire. Une dérégulation de cette kinase, entraînant des problèmes cellulaires spécifiques des cellules cancéreuses, Aurora-B est reconnue comme étant un proto-oncogène. III-3/ La kinase Aurora-A La kinase Aurora-A est impliquée dans la duplication et la séparation des centrosomes ainsi que dans l assemblage et la maintenance du fuseau. La plupart des études menées chez divers organismes ont montré que la perturbation de la fonction d Aurora-A ou sa sur-expression, entraîne des anomalies centrosomales, notamment lors de la séparation des centrosomes dupliqués, conduisant à des phénomènes de polyploïdie. Comme Aurora-B, la kinase Aurora-A est alors perçue comme potentiellement oncogénique. L expression et l activité kinasique d Aurora-A doivent être parfaitement régulées tout au long du cycle cellulaire. III-3-a/ Régulation de l expression d Aurora-A Aurora-A est exprimée à partir de la phase S avec un pic d expression maximal en phase G2, elle disparaît rapidement après la mitose et son niveau et quasiment nul en phase G1, laissant suggérer que la protéine est dégradée en fin de mitose/début de phase G1. De nombreux travaux ont été réalisés pour comprendre les mécanismes de dégradation de la protéine Aurora-A. Ils ont permis d admettre que la kinase subit une dégradation ubiquitine dépendante par le protéasome. Les protéines ubiquitinylées et dégradées en sortie de mitose et en début de phase G1 sont en général des substrats de l APC. Comme nous l avons vue avant : Les kinases Aurora possèdent en C- terminal de leur séquence primaire une boîte de destruction «D-box» et les complexes APC/Cdc20 et APC/Cdh1 reconnaissent et ubiquitinylent spécifiquement des protéines possédant un motif «D-box». Cependant, toutes les protéines de la famille Aurora ne sont pas des substrats de l APC. La kinase Aurora- B n est ni un substrat de l APC/Cdc20, ni un substrat de l APC/Cdh1 (Castro et al., 2002b). En revanche, Aurora-A est reconnue et ubiquitinylé par APC/Cdh1 mais pas par APC/Cdc20 (Castro et al., 2002a). La protéine Aurora-A possèderait alors dans la partie N-terminale de sa séquence primaire, qui est, rappelons le, spécifique de chaque kinase, une séquence «signal» responsable de la dégradation de la protéine. Les études menées par Castro et al., en 2002, ont permis de mettre en évidence l existence dans la partie N- terminale d Aurora-A d une séquence activatrice de la «D-box». Cette séquence est appelée DAD (D-box EPHE Banque de Monographies SVT 20