Biologie Moléculaire & Génie Génétique

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1 Biologie Moléculaire & Génie Génétique 6GT SG&SB FWB A.R. d sneux Maître de Stage: Sylvie Bossrez Stagiaire: Pierre LCOCQ Important! Les leçons seront publiées intégralement APRS avoir été données sur le site WB et lien suivant: Vous avez donc tout intérêt même si le support sera fourni, à être attentif et prendre des notes dès maintenant 1

2 Introduction & Plan du cours N Les leçons proposées dans ce document s adressent aux élèves de 6-ième Générale/Transition, Sciences Générales (2P/sem) ou/et Sciences de Base (1P/sem). lles portent sur l acquisition de compétences/connaissances en matière d ADN, ARN et Protéines et de méthodologie expérimentale. Le contenu est identique pour les 6GTSG et 6GTSB. Toutefois les 6GTSB n auront pas la possibilité de mettre réellement en pratique la partie expérimentale. Mais ils pourront la visualiser sur base de résultats obtenus par les 6GTSG (en temps réel ou via photos / documents). De plus les 6GTSB disposeront du contenu mais ne recevront pas nécessairement l input direct concernant certains exemples d application (exemple: VIH) Outre la partie expérimentale (mise en pratique), les évaluations données en fin de document sont également différentes (même si elles portent sur la même matière). Leçons Titre/Contenu 6 GT SG 1 ADN, Transgénèse, Plasmides, nzymes de Restrictions, PCR, Clonage et Séquençage. 6 GT SG 2 ADN, Transgénèse, Plasmides, nzymes de Restrictions, PCR, Clonage et Séquençage + Intro aux Labos d lectrophorèse et de Transformation Cellulaire. 6 GT SG 3 Labos d lectrophorèse et de Transformation Cellulaire. 6 GT SG 4 Analyse des Résultats expérimentaux + Thérapie Génique, Next Generation Sequencing, VIH, Bioinformatics 6 GT SG 5 Thérapie Génique, Next Generation Sequencing, VIH, Bioinformatics + Info. valuation. 6 GT SG 6 valuation. 6 GT SB 1 ADN, Transgénèse, Plasmides, nzymes de Restrictions, PCR, Clonage et Séquençage. 6 GT SB 2 ADN, Transgénèse, Plasmides, nzymes de Restrictions, PCR, Clonage et Séquençage + Info. valuation. 6 GT SB 3 valuation + Thérapie Génique, Next Generation Sequencing, VIH Bioinformatics (selon temps disponible) Format des leçons: Groupes de Travail (3-4 élèves)! 1 «IN» par groupe minimum. G Groupe d lèves N/B G Groupe d lèves Couleur? = Questionner lèves lèves N/B lèves Couleur P Professeur N Ne pas imprimer 2

3 ADN, ARN & Protéines: valuation des Connaissances (1a) G Comme la mémoire fait parfois défaut et qu en sus il s agit d une question de 1ier BAC Ulg (cours de M. Thiry): Travail de groupe (3-4) & «Consultation autorisée». Soit le fragment d ADN ci-dessous où les bases soulignées représentent des sites potentiels d initiation de la transcription et où les bases en minuscule représentent des introns. 5 - AAGCGGCTACaatgccgcTCGCCTATgccaccccgtGCCCCGCCTAGccgctaaGGGATT TTCGCCGATGttacggcgAGCGGATAcggtggggcaCGGGGCGGATCggcgattCCCTAA TCAGCTAGCGGATTAAGCATAT AGTCGATCGCCTAATTCGTATA -5 L un de ces deux brins code pour un petit peptide. 1. Identifiez le brin sens. Justifiez votre réponse. 2. crivez la séquence de l'arnm, telle qu elle se présente dans le cytoplasme. 3. Donnez la séquence en acides aminés du polypeptide obtenu après traduction. 4. Ce fragment d ADN pourrait-il correspondre à un gène bactérien? Justifiez. 5. Lorsque les cellules contenant ce gène sont soumises à un choc thermique, un épissage alternatif excluant l exon 3 se produit. Quelle répercussion cela aura-t-il sur le peptide produit? Pour vous faciliter la tâche voici (figure 1) le code International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC; 1970). Figure 1 Vous avez 15 minutes à partir de maintenant! Source: New ngland Biolabs? 3

4 ADN, ARN & Protéines: valuation des Connaissances (1a) Comme la mémoire fait parfois défaut et qu en sus il s agit d une question de 1ier BAC Ulg (cours de M. Thiry): Travail de groupe (3-4) & «Consultation autorisée». Soit le fragment d ADN ci-dessous où les bases soulignées représentent des sites potentiels d initiation de la transcription et où les bases en minuscule représentent des introns. 5 - AAGCGGCTACaatgccgcTCGCCTATgccaccccgtGCCCCGCCTAGccgctaaGGGATT TTCGCCGATGttacggcgAGCGGATAcggtggggcaCGGGGCGGATCggcgattCCCTAA TCAGCTAGCGGATTAAGCATAT AGTCGATCGCCTAATTCGTATA Identifiez le brin sens. Justifiez votre réponse. L un de ces deux brins code pour un petit peptide. 2. crivez la séquence de l'arnm, telle qu elle se présente dans le cytoplasme. 3. Donnez la séquence en acides aminés du polypeptide obtenu après traduction. 4. Ce fragment d ADN pourrait-il correspondre à un gène bactérien? Justifiez. 5. Lorsque les cellules contenant ce gène sont soumises à un choc thermique, un épissage alternatif excluant l exon 3 se produit. Quelle répercussion cela aura-t-il sur le peptide produit? 4

5 ADN, ARN & Protéines: valuation des Connaissances (1b) 1. Identifiez le brin sens. Justifiez votre réponse. P On «oublie» les introns (minuscules car ils vont disparaitre lors de la maturation de l ARNm) T ce qui est en amont (coté 5 ) du site d initiation de la transcription (tout simplement parce que cela ne fera pas partie de l ARNm primaire = «Transcrit»). On démarre en 5 au site d initiation et on cherche un ATG (le premier) et ensuite le premier codon STOP en phase. Ce qui donne donc (couleurs pour faciliter la visualisation): 5 -AAGCGGCTACTCGCCTATGCCCCGCCTAGGGGATTTCAGCTAGCGGATTAAGCATAT-3 3 -TTCGCCGATGAGCGGATACGGGGCGGATCCCCTAAAGTCGATCGCCTAATTCGTATA-5 Réponse: C est le brin du haut le seul à posséder la séquence 5 -ATG - 3 Remarque: n pratique on prend le premier ATG qu on trouve après le site d initiation de la transcription. Mais la «Nature» est la championne du monde pour nous réserver des surprises! t on ne trouve pas toujours un codon Stop car la séquence communiquée peutêtre incomplète ou/et incorrecte (ou l on trouve un faux codon Stop) 2. crivez la séquence de l'arnm, telle qu elle se présente dans le cytoplasme. Attention: Il s agit d une ARN (T / U) et dans le cytoplasme = après maturation! Splicing (épissage) des introns (voir point 1) Coiffe (7méthylGuanosine) et queue poly A (stabilité du ARNm) au signal de polyadénylation (AAUAAA mais variantes ) 3. Donnez la séquence en acides aminés du polypeptide obtenu après traduction. 4. Ce fragment d ADN pourrait-il correspondre à un gène bactérien? Justifiez. xons/introns Uniquement (presque) chez les ukaryotes! 5. Lorsque les cellules contenant ce gène sont soumises à un choc thermique, un épissage alternatif excluant l exon 3 se produit. Quelle répercussion cela aura-t-il sur le peptide produit? 5

6 Introduction à la «biologie moléculaire»: La Transgénèse (exemple.coli) Source: Figure 2 Résultat: La bactérie synthétise la protéine humaine grâce au transgène présent dans son ADN recombiné. Questions: Comment? Quelles méthodes utilise-t-on? Remarque importante à propos du transgène? Il ne doit pas contenir d introns mais uniquement la séquence codante de l ATG (Méthionine) au codon STOP car la bactérie ne fait pas d épissage, n utilise pas le promoteur ucaryote ni la «queue PolyA+» 6

7 Travail de groupe (3-4) La PCR (Polymerase Chain Reaction) (1/6) N Visionnez attentivement la video (prenez des notes). Puis répondez aux questions qui suivent. Vocabulaire (Anglais vs. Français) Sample chantillon Small Petit Target Cible Single Unique Primer Amorce Fingerprinting mpreinte DNA ADN Involving Impliquant Amount Quantité Carry out Réaliser, générer, créer Polimerase Polymerase (erreur) Annealing Appariemment Length Longueur (taille en bp) 7

8 La PCR (Polymerase Chain Reaction) (2/6) Travail de groupe (3-4). Visionnez attentivement la video (prenez des notes). Puis essayez de répondre aux questions. Vocabulaire (Anglais vs. Français) Sample chantillon Small Petit Target Cible Single Unique Primer Amorce Fingerprinting mpreinte DNA ADN Involving Impliquant Amount Quantité Carry out Réaliser, générer, créer Polimerase Polymerase (erreur) Annealing Appariement Length Longueur (taille en bp) Questions. Un chercheur de chez Janssen Diagnostics (JnJ) a isolé l ARN du virus VIH (rétrovirus, SIDA) à partir d un échantillon de sang d un patient. Il en a fait une copie ADN double-brin (partielle; la région codant pour la Protéase du virus) en utilisant une Reverse Transcriptase. Avant de procéder au séquençage (double brin) de ce fragment, il doit l amplifier par PCR. Il sait que le VIH est un virus qui a la particularité de modifier (mutations) très fortement la séquence codante pour la protéase (soulignée) mais par contre pas les régions en amont et en aval de celle-ci. Aidez-le à faire le «design» de 2 amorces pour amplifier l entièreté de la région codante de la Protéase sur base de la séquence nucléotidique (brin codant 5 vers 3 ) ci-dessous en sachant que : 1. La taille minimale d une amorce doit être de 18 nucléotides 2. Il est préférable que l amorce se termine en 3 par un G ou un C 3. n première approximation la température d appariement (mt ) doit être au minimum de 54 C et que les 2 les amorces doivent avoir approximativement (+/- 2 C) les mêmes mt. Formule de Wallace pour le calcul: mt = 4 x Σ GC + 2 x Σ AT (en C) Séquence du variant HXB2, le VIH utilisé comme référence pour l analyse des séquences VIH. 8

9 La PCR (Polymerase Chain Reaction) (3/6) 2161 ccaccagaag agagcttcag gtctggggta gagacaacaa ctccccctca gaagcaggag 2221 ccgatagaca aggaactgta tcctttaact tccctcaggt cactctttgg caacgacccc 2281 tcgtcacaat aaagataggg gggcaactaa aggaagctct attagataca ggagcagatg 2341 atacagtatt agaagaaatg agtttgccag gaagatggaa accaaaaatg atagggggaa 2401 ttggaggttt tatcaaagta agacagtatg atcagatact catagaaatc tgtggacata 2461 aagctatagg tacagtatta gtaggaccta cacctgtcaa cataattgga agaaatctgt 2521 tgactcagat tggttgcact ttaaattttc ccattagccc tattgagact gtaccagtaa 2581 aattaaagcc aggaatggat ggcccaaaag ttaaacaatg gccattgaca gaagaaaaaa La région en rouge (soulignée dans l énoncé) est celle dont le chercheur souhaite (au final) obtenir la séquence nucléotidique. Toutes les amorces doivent donc être choisies en amont et en aval. Oublions le séquençage et la RT-PCR, concentrons-nous sur l amplification! Amont: 5 ccaccagaagagagcttcaggtctggggtagagacaacaactccccctca 3 5 gaagcaggagccgatagacaaggaactgtatcctttaacttc Wallace mt Cumulative mt Position from Aval (séquence complémentaire réécrite 5 vers 3!!!): 5 ttttttcttctgtcaatggccattgtttaacttttgggccatccattcct 3 5 ggctttaattttactggtacagtctcaatagggctaatggg Wallace mt Cumulative mt Position from amorces utilisables (mt = 68 C) en PCR pourraient être: Amont: 5 caaggaactgtatcctttaacttc 3 (24 mer) Aval: 5 acagtctcaatagggctaatggg 3 (23 mer) 9

10 La PCR (Polymerase Chain Reaction) (4/6) L'amplification en chaîne par polymérase ou réaction en chaîne par polymérase (PCR est l'abréviation anglaise de Polymerase Chain Reaction) est une méthode de biologie moléculaire d'amplification génique in vitro, qui permet de dupliquer en grand nombre (avec un facteur de multiplication de l'ordre du milliard) une séquence d'adn ou d'arn connue, à partir d'une faible quantité (de l'ordre de quelques picogrammes) d'acide nucléique (séquence spécifique d ADN (l Amplicon)) et d'amorces spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse de 20 à 25 nucléotides). On peut ainsi, par exemple, détecter la présence du virus VIH ou de mesurer une charge virale (concentration du virus dans le plasma), des traces d'ogm (organismes génétiquement modifiés), ou encore des virus d'hépatites B, C et D. De plus en plus utilisée en criminalistique, cette technique se fonde sur la combinaison de deux facteurs : 1. Les propriétés de synthèse enzymatique et d initiation spécifique à l'adn double brins spécifique des ADN polymérases dépendantes à l'adn thermostables. 2. Les propriétés d hybridation et de déshybridation des brins complémentaires d ADN en fonction de la température. Ces éléments permettent de contrôler l activité enzymatique grâce à des transitions de température (assurées par un thermocycleur) répétées de manière cyclique (cf. réaction en chaîne). Les premières ADN polymérases utilisées provenaient d'une bactérie thermophile (résistante à des températures très élevées), par exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase) ou encore Pyrococcus furiosus (Pfu polymérase), Thermococcus litoralis (Vent ou Tli polymérase), Thermus thermophilus (Tth polymérase). De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes (créées par construction génétique), ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces, plus fidèles La figure 3 page suivante schématise le processus de PCR. 10

11 La PCR (Polymerase Chain Reaction) (5/6) L'amplification en chaîne par polymérase ou réaction en chaîne par polymérase (PCR) Figure 3 Source: 11

12 La PCR (Polymerase Chain Reaction) (6/6) N L'amplification en chaîne par polymérase ou réaction en chaîne par polymérase (PCR) Real live lab practice Source: 12

13 Clonage et Séquençage Toutefois notre chercheur ne va pas «commander» ces 2 amorces. Car il a des objectifs très particuliers (voir ci-dessous). t il va commander 4 amorces dont les séquences sont représentées ci dessous. Nous allons voir le pourquoi de cette approche. Mais pour mieux la comprendre il est nécessaire que nous nous informions d avantage sur le clonage et le séquençage. T la stratégie / les objectifs que ce chercheur a dans la tête! Répondons-y tout de suite. Le chercheur souhaite: 1. Séquencer le produit de PCR (Sanger) 2. Séquencer 100 clones contenant le produit de PCR (Sanger) 3. Séquencer le produit de PCR (NGS = Next Generation Sequencing) Pourquoi? Quand on prélève un échantillon de sang d un patient infecté par le VIH très souvent il s avère que plusieurs «sous - populations» de virus coexistent. t ne présentent pas la même séquence d ARN (mutations). t par conséquent ne vont pas «résister» aux médicaments «antivih» de la même manière. Si l on séquence le produit de PCR directement, on obtient une séquence globale (de l ensemble des sous-populations) par contre le séquençage d un clone est spécifique d une sous-population. Il va donc amplifier par PCR et séquencer (Sanger). n fonction des résultats (présence de plusieurs sous-populations), cloner et séquencer 100 clones et ensuite soumettre le produit de PCR au séquençage NGS. Amorces de Séquençage (SQ) et de PCR/Clonage (PCR): Amont: 5 ccaccagaagagagcttcaggtctggggtagagacaacaactccccctca 3 5 agggaattcgtagagacaacaactccccctc 3 PCR_F 5 gaagcaggagccgatagacaaggaactgtatcctttaacttc 3 5 gaagcaggagccgatagacaag 3 SQ_F Aval (séquence complémentaire réécrite 5 vers 3!!!): 5 ttttttcttctgtcaatggccattgtttaacttttgggccatccattcct 3 5 atggaattcgtttaacttttgggccatccattcc 3 PCR_R 5 ggctttaattttactggtacagtctcaatagggctaatggg 3 5 ggctttaattttactggtacag 3 SQ_R F stands for Forward, R stands for Reverse 13

14 Les Plasmides: Introduction. Un plasmide désigne en microbiologie ou en biologie moléculaire une molécule d'adn surnuméraire distincte de l'adn chromosomique, capable de réplication autonome et non essentielle à la survie de la cellule. Les plasmides sont généralement circulaires. Ils se trouvent quasi-exclusivement dans les bactéries (mais aussi Saccharomyces cerevisiae ou levure de boulangerie). Une cellule bactérienne peut en contenir une copie, pour les grands plasmides (aussi appelés cosmides), ou des centaines pour des plasmides artificiels (construits par génie génétique à des fins de clonage de gènes). Les bactéries en comportent généralement 5 à 30 copies, les levures entre 50 et 100 exemplaires par cellule. Les gènes de plasmides sont non-nécessaires mais avantageux pour la bactérie. Bacterial DNA Plasmid DNA Sites reconnus par des nzymes de Restriction (positions) MCS: Multiple Cloning Site. Beta Galactosidase interruption. Gènes (beta-gal /antibiotics resistance) / origine de réplication présents sur le plasmide. Plusieurs plasmides différents peuvent coexister dans une même cellule sous condition de leur compatibilité mutuelle. Les plasmides participent aux transferts horizontaux de gènes entre les populations bactériennes, et donc à la dissémination des gènes conférant des avantages sélectifs (par exemple des résistances aux antibiotiques ). 14

15 Les plasmides (ex puc19): Caractéristiques et utilisations. (1/2) Le puc19 comme ses très nombreux frères fut (et est toujours) abondamment utilisé pour cloner des fragments d ADN à des fins de séquençage ou/et pour réaliser des constructions génétiques. L évolution technologique des méthodes de séquençage (Next Generation Sequencing) limite actuellement son utilisation plutôt au second aspect. Le MCS (Multiple Cloning Sites) Les MCS sont des lieux où la présence de sites (séquences nucléotidiques) de restriction (digestion = coupure) uniques (présent une seule fois dans la séquence du plasmide) permet d insérer des fragments d ADN dans des endroits où certaines propriétés du plasmide donnent à ces insertions la possibilité d étudier expérimentalement le fragment inséré (exemples: séquençage, expression = synthèse protéique) Les fragments d ADN «insérés» sont principalement des fragments de «restriction» (donc obtenus en digérant l ADN par des enzymes de restriction), de «sonication» (obtenus par «cassure» physico-chimique de l ADN; exemple = ultrasons) ou «d amplicons» (fragments d ADN obtenu par amplification 15 PCR = «Polymerase Chain Reaction»).

16 Les plasmides (ex puc19): Caractéristiques et utilisations. (2/2) Les plasmide de type puc ont eu un énorme succès grâce à l une de leurs propriétés: La complémentation par le plasmide du gène lacz déficient chez la bactérie hôte. Pour faire simple (mais c est quand même très compliqué): le gène lacz présent chez la bactérie hôte code pour une protéine, la β-galactosidase. Celle-ci est une enzyme capable d hydrolyser le substrat X-gal en le transformant en un produit de couleur bleu. Mais cette enzyme ne fonctionne que si on la «dope» avec une autre molécule l IPTG car celui bloque l action d un «opéron» répresseur (Laci) du gène lacz. Donc sans IPTG, le répresseur est actif et il n y a pas de synthèse de β-galactosidase. Jusque là tout va bien. On ajoute de l IPTG et de l X-gal dans le milieu et «boum» la β- galactosidase est synthétisée et les colonies (ensemble de bactéries issues d une seule bactérie mère) qui hydrolysent le X-gal deviennent bleues. Admettons maintenant que le gène lacz de la bactérie soit «altéré»: on lui a enlevé quelques nucléotides et donc il n est plus fonctionnel. Sauf si un plasmide de type puc est porteur du gène LacZ et vient «complémenter» (transformation) celui déficient de la bactérie et la colonie est bleue. Le truc génial: Le MCS du plasmide est placé juste au début du gène LacZ. Donc si vous insérez un fragment à cet endroit: terminé la complémentation et donc la colonie reste blanche Donc on sait qu un fragment est inséré dans les plasmides des colonies blanches. Pick the white ones and analyze! Couplé au sein d un plasmide avec un promoteur de réplication performant et un gène de résistance à un antibiotique ceci donne un outil extrêmement efficace et utilisé à profusion pendant les 3 dernières décennies! 16

17 Les Fragments d ADN obtenus par Digestion de Restriction Comme nous venons de le voir les plasmides de type puc font partie du quotidien du Biologiste Moléculaire. Ils permettent d y insérer des fragments d ADN dans une structure connue, de repérer après transformation (ajout du plasmide à la bactérie) de bactéries, les colonies où cette insertion a eu lieu, de sélectionner ces colonies pour amplifier/obtenir en grande quantité (multiplier les bactéries en milieu de culture ) ces plasmides contenant le fragment et enfin analyser le contenu (fragments d ADN insérés) des plasmides. Revenons à notre chercheur et aux 2 amorces PCR qu il a commandées (séquences codessous). Que distinguons-nous? Amont: 5 ccaccagaagagagcttcaggtctggggtagagacaacaactccccctca 3 5 agggaattcgtagagacaacaactccccctc 3 PCR_F 5 gaagcaggagccgatagacaaggaactgtatcctttaacttc 3 5 gaagcaggagccgatagacaag 3 SQ_F Aval (séquence complémentaire réécrite 5 vers 3!!!): 5 ttttttcttctgtcaatggccattgtttaacttttgggccatccattcct 3 5 atggaattcgtttaacttttgggccatccattcc 3 PCR_R 5 ggctttaattttactggtacagtctcaatagggctaatggg 3 5 ggctttaattttactggtacag 3 SQ_R 1. Une première partie de l amorce (en 3 ) qui possède une séquence d ADN parfaitement identique à celle du fragment à amplifier (ADN cible). 2. t en amont (une «queue») une séquence 5 agggaattc 3 ou 5 atggaattc 3 qui ne correspond pas exactement à celle de l ADN cible. Pourquoi? La séquence 5 GAATTC 3 est une séquence reconnue par une enzyme de restriction (cori) capable de couper l ADN et rappelez-vous, notre chercheur souhaite «cloner» (insérer) le fragment amplifié par PCR dans un plasmide, le puc19 dans le cas présent. Or si l on regarde bien le Multiple Cloning Site du puc19 que voit-on? Un site unique cori! Notre chercheur va donc faire d une pierre deux coups! Amplifier par PCR et après coupure par l enzyme de restriction, cloner le produit de la PCR! Avant d aller plus loin Intéressons-nous un peu aux nzymes de Restriction et au clonage. (en théorie et en pratique: Labo d électrophorèse d ADN en gel agarose et de «transformation» bactérienne). 17

18 Les digestions de restriction (nzymes de Restriction R) Une enzyme de restriction (R) est une protéine qui peut couper un fragment d'adn au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée site de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnaît ainsi un site spécifique. Plusieurs centaines d'enzymes de restriction sont actuellement connues, on en retrouve naturellement dans un grand nombre d'espèces de bactéries. Ces enzymes sont naturellement présentes chez les bactéries où elles constituent un mécanisme de défense contre les infections par les bactériophages, des virus spécifiques des bactéries. Lorsque le virus injecte son ADN dans le micro-organisme, celui-ci est coupé par l'enzyme de restriction au niveau de ses sites spécifiques. La destruction du génome du virus bloque ainsi l'infection. Le nom d'enzyme de restriction provient de ce mécanisme, en effet la présence de ces enzymes dans les bactéries restreint l'infectiosité des bactériophages. Pour éviter que l'enzyme de restriction ne coupe l'adn de son propre génome, la bactérie fabrique aussi une deuxième enzyme appelée méthylase qui reconnaît également le site de restriction. La méthylase ne coupe pas l'adn, mais le modifie en lui rajoutant un groupement méthyle sur un ou plusieurs nucléotides du site. Cette méthylation empêche la coupure par l'enzyme de restriction. Ce mécanisme de défense, appelé système de restriction/modification, associe systématiquement ces deux enzymes, l'une de coupure et l'autre de protection. t ces enzymes ont été mise à profit en Biologie Moléculaire pour «travailler» l ADN, le coupant expérimentalement en des endroit précis et en réassociant ensuite ces fragments. Les R portent un nom (exemple: cori) souvent une abréviation de son origine bactérienne et/ou son «découvreur». Ce qui n indique nullement la nature de la séquence d ADN qu elles reconnaissent et la manière dont elles vont couper l ADN dans cette région! Donc le Biologiste Moléculaire consultera une base de données sur les enzymes de restrictions (exemple ) afin d identifier la/les R existante(s) et pouvant convenir à son projet de construction. Dans ces bases de données vous trouverez entre autres: Nom de la R, son fournisseur («supplier») et bien sûr sa séquence cible («target») et la manière dont elle coupe l ADN. xemple: cori (vendu par de très nombreux suppliers) reconnait et coupe l ADN: 5 - G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G -5 Remarques: cori est dit 5 sortant (vs. 3 sortant ou blunt -end) et comme énormément de R reconnait une séquence palindromique (= même lecture 5 vers 3 sur les 2 brins d ADN) 18

19 Les digestions de restriction (nzymes de Restriction R) Op1a Il existe plusieurs centaines d R identifiées et commercialisées. t de très nombreux «software packages» (programmes informatiques) qui sur base d une séquence nucléotidique que vous communiquez vont les repérer et vous permettre de définir une stratégie pour «cloner» (= insérer dans un plasmide) un fragment d ADN connu en un lieu précis. Question («tuyau» pour évaluation): Sachant que l enzyme cori reconnait la séquence 5 GAATTC 3 quelle est la probabilité (approximativement) de retrouver cette séquence dans un fragment d ADN inconnu de plus ou moins 1,000 bp (bp = paire de nucléotides)? Tuyau: cori reconnait une séquence palindromique Le clonage «en vrac»: Création de Bibliothèques d ADN génomique («shotgun»). Imaginons que vous souhaitiez obtenir la séquence nucléotidique complète d un génome (ADN) X inconnu de taille assez importante. Dans ce cas de figure, les chercheurs ont utilisés les R de la manière suivante: 1. Digérer par des R reconnaissant des sites de restriction courts (4 bp) et donc fréquents, et cloner tous ces «petits fragments» et les séquencer. 2. Casser l ADN aléatoirement (de manière physico-chimique; exemple = sonication) et ensuite cloner tous ces «petits fragments» et les séquencer. Cette méthodologie est reprise sous le terme de création de «bibliothèque» de l ADN X. Nous verrons aussi que le clonage de fragments obtenus par PCR ou RT-PCR fait aussi appel aux R pour positionner ceux-ci aux emplacements requis pour les séquencer ou/et réaliser des constructions. A noter: L apparition des «Next Generation Sequensing» en début de XXI siècle a fortement réduit l utilisation des plasmides et de clonage «R» et limite donc leur utilisation à la réalisation de «constructions» (exemple: transgénèse). 19

20 Les digestions de restriction (nzymes de Restriction R) Op1b P Il existe plusieurs centaines d R identifiées et commercialisées. t de très nombreux «software packages» (programmes informatiques) qui sur base d une séquence nucléotidique que vous communiquez vont les repérer et vous permettre de définir une stratégie pour «cloner» (= insérer dans un plasmide) un fragment d ADN connu en un lieu précis. Question (tuyau pour évaluation): Sachant que l enzyme cori reconnait la séquence 5 GAATTC 3 quelle est la probabilité (approximativement) de retrouver cette séquence dans un fragment d ADN inconnu de plus ou moins 1,000 bp (bp = paire de nucléotides)? Tuyau: cori reconnait une séquence palindromique G x A x A x T x T x C 4 x 4 x 4 x 4 x 4 x 4 = 4096 Donc cette séquence n apparaitra en moyenne qu une fois toutes les 4096 bp. BP car comme elle est palindromique si elle existe dans un sens, elle l est forcément dans l autre! Inutile de s attaquer au brin complémentaire! (dans le cas de séquences non palindromiques: multipliez par 2 = 8192 bp) La probabilité approximative est donc de 1000/4096 1/4 Le clonage «en vrac»: Création de Bibliothèques d ADN génomique («shotgun»). Imaginons que vous souhaitiez obtenir la séquence nucléotidique complète d un génome (ADN) X inconnu de taille assez importante. Dans ce cas de figure, les chercheurs ont utilisés les R de la manière suivante: 1. Digérer par des R reconnaissant des sites de restriction courts (4 bp) et donc fréquents, et cloner tous ces «petits fragments» et les séquencer. 2. Casser l ADN aléatoirement (de manière physico-chimique) et ensuite cloner tous ces «petits fragments» et les séquencer. Cette méthodologie est reprise sous le terme de création de «bibliothèque» de l ADN X. Nous verrons aussi que le clonage de fragments obtenus par PCR ou RT-PCR fait aussi appel aux R pour positionner ceux-ci aux emplacements requis pour les séquencer ou/et réaliser des constructions. A noter: L apparition des «Next Generation Sequensing» en début de XXI siècle a fortement réduit l utilisation des plasmides et des clonages «R» pour le séquençage et limite donc leur utilisation à la réalisation de «constructions» (exemple: transgénèse). 20

21 Les Fragments d ADN obtenus par Digestion de Restriction Comme nous venons de le voir les plasmides de type puc font partie du quotidien du Biologiste Moléculaire. Ils permettent d y insérer des fragments d ADN dans une structure connue, de repérer après transformation de bactéries, les colonies où cette insertion a eu lieu, de sélectionner ces colonies pour amplifier (produire en grande quantité) ces plasmides contenant le fragment et enfin analyser le contenu (fragment d ADN) des plasmides. 1. Que souhaite-t-on insérer comme fragment d ADN? Comment procéder en fonction du type de fragment et avec quel(s) objectif(s)? A. Des fragments obtenus par digestion(s) de restriction. B. Des fragments obtenus par cassure physico-chimique. C. Des fragments obtenus par PCR (Polymerase Chain Reaction) ou RT-PCR. 2. Comment analyser ces fragments d ADN et vérifier que l on a bien atteint les objectifs? A. La vérification par digestion(s) de restriction de l insertion correcte des fragments (dans le cadre d une construction). B. Le séquençage nucléotidiques de tout ou partie des fragments Dans le cadre de cette série de leçons nous mettrons en pratique: 1. La transformation de cellules bactériennes = intégrer à une bactérie un nouveau plasmide. 2. La vérification par digestions de restriction de la structure d un plasmide (électrophorèse en gel d agarose) Mais auparavant voici quelques notions complémentaires 21

22 Caractérisation du plasmide pk7d4-diy (BCCM #4282) par digestions de restriction et électrophorèse des fragments de restrictions. Labo. Identification de la taille et de la structure du plasmide. pk7d4-diy (BCCM #4282) par digestions de restriction et électrophorèse des fragments de restrictions sur gel d agarose. Travail de groupe (2--5) Groupe 1. Digestion de 50 ng du plasmide pk7d4-diy par XbaI (peu de sites) Groupe 2. Digestion de 700 ng du plasmide pk7d4-diy par cori (très nombreux sites) Groupe 3. Digestion de 140 ng du plasmide pk7d4-diy par BamHI (peu de sites) Groupe 4. Digestion de 140 ng du plasmide pk7d4-diy par HindIII (peu de sites) Groupe 5. Digestion de 140 ng du plasmide pk7d4-diy par XhoI (peu de sites) n conditions optimales (température, tampon) 1 Unité d nzyme de Restriction (exemple cori) digère 1 μg (1,000 ng) de λ DNA / heure dans un volume de 50 µl. Important: Le λ DNA (bactériophage à ADN linéaire avoisinnant les 45,000 bp) posséde 5 sites de restriction cori (donc 6 fragments après digestion de restriction; voir ci-dessous). Important: Les nzymes de restrictions sont en général commercialisés au format 10 U / 1 μl et utilisés en digestion de restriction à un maximum de 1 U / 1 μl sur une concentration maximale de 1 μg d ADN dans 10 μl. Dans ces conditions avec le tampon adapté, 1 heure de réaction à la température optimale permet de «digérer» 99,99% des sites de restriction. TOUTFOIS par «prudence» les biologistes moléculaires évitent de «fleurter» avec ces conditions «borderline». 110 / mg soit 110,000 / g OR: 40 / g 1 Kg de DNA Ladder 100,000,000 Le phage λ DNA et diverses de ses digestions de restrictions furent les premiers utilisés comme marqueurs de poids moléculaires d ADN = références = DNA ladders permettant d estimer la taille et la concentration de fragments d ADN inconnus.dans le courant des années 90 il fut progressivement remplacé par d autres DNA ladders aux caractéristiques plus intéressantes (citons par exemples le 1Kb DNA Ladder de Boehringher Mannheim ou encore le Smartladder de chez urogentec) lectrophorèse en gel d agarose 1,2% / TA et coloration au Brt. 1. SmartLadder 2. SmartSharp 3. 1 Kb+ 4. HindIII phage λ DNA 22

23 Caractérisation du plasmide pk7d4-diy (BCCM #4282) par digestions de restriction et électrophorèse des fragments de restrictions. Labo. Identification de la taille et de la structure du plasmide. pk7d4-diy (BCCM #4282) par digestions de restriction et électrophorèse des fragments de restrictions sur gel d agarose. Travail de groupe (2--5) Groupe 1. Digestion de 100 ng du plasmide pk7d4-diy par XbaI (peu de sites) Groupe 2. Digestion de 1,400 ng du plasmide pk7d4-diy par cori (très nombreux sites) Groupe 3. Digestion de 280 ng du plasmide pk7d4-diy par BamHI (peu de sites) Groupe 4. Digestion de 280 ng du plasmide pk7d4-diy par HindIII (peu de sites) Groupe 5. Digestion de 280 ng du plasmide pk7d4-diy par XhoI (peu de sites) n conditions optimales (température, tampon) 1 Unité d nzyme de Restriction (exemple cori) digère 1 μg (1,000 ng) de λ DNA / heure dans un volume de 50 µl. Important: Le λ DNA (bactériophage à ADN linéaire avoisinnant les 45,000 bp) posséde 5 sites de restriction cori (donc 6 fragments après digestion de restriction; voir ci-dessous). Important: Les nzymes de restrictions sont en général commercialisés au format 10 U / 1 μl et utilisés en digestion de restriction à un maximum de 1 U / 1 μl sur une concentration maximale de 1 μg d ADN dans 10 μl. Dans ces conditions avec le tampon adapté, 1 heure de réaction à la température optimale permet de «digérer» 99,99% des sites de restriction. TOUTFOIS par «prudence» les biologistes moléculaires évitent de «fleurter» avec ces conditions «borderline». 110 / mg soit 110,000 / g OR: 40 / g 1 Kg de DNA Ladder 100,000,000 Le phage λ DNA et diverses de ses digestions de restrictions furent les premiers utilisés comme marqueurs de poids moléculaires d ADN = références = DNA ladders permettant d estimer la taille et la concentration de fragments d ADN inconnus.dans le courant des années 90 il fut progressivement remplacé par d autres DNA ladders aux caractéristiques plus intéressantes (citons par exemples le 1Kb DNA Ladder de Boehringher Mannheim ou encore le Smartladder de chez urogentec) lectrophorèse en gel d agarose 1,2% / TA et coloration au Brt. 1. SmartLadder 2. SmartSharp 3. 1 Kb+ 4. HindIII phage λ DNA 23

24 Caractérisation du plasmide pk7d4-diy (BCCM #4282) par digestions de restriction et électrophorèse des fragments de restrictions. Protocole expérimental. 1. Disposant du tampon requis (correspondant à l enzyme de restriction; 10 x concentré), d une solution mère d ADN du plasmide à 500 ng/μl et d eau distillée stérile, réalisez une digestion de restriction sur les quantités d ADN plasmidien prescrites et à raison de 5 unités par μg d ADN et dans un volume final de 20 μl. Au besoin réalisez des dilutions Merci de travailler «sur glace». Avant l incubation. 2. Placez à température optimale pour incubation pendant 1 heure. 3. Préparez un gel d agarose 1,2% 1 x TA (40mM Tris-Acétate, 1mM DTA; 200 ml sur agitateur magnétique chauffant ou au microondes). Prenez des gants de protection pour manipuler les erlenmeyers! Pendant le temps de chauffe, préparez le «bac» d électrophorèse et la quantité de tampon TA 1x nécessaire pour remplir le «bac». Vérifiez les connections (positif/négatif Les acides nucléiques sont chargés négativement ). Mettez en place la chambre de réception du gel. 4. Lorsque le mélange du gel est uniforme et liquide (faites gaffe cela sort de l erlen à ébullition donc à surveiller), ajoutez 10 μl de Bromure d thidium à 10 mg/ml et agitez bien. Coulez le gel (n oubliez pas le «peigne») et laissez refroidir. 5. Préparez un ppendorf 1,5 ml avec 500 µl de phenol/chloro 50/50; un second avec 500 µl d eau, un troisième avec 500 µl d isopropanol. Mettez le tout sur glace. (pour les 5 groupes) 6. Stoppez la réaction en la plaçant sur glace et en ajoutant 2 µl d DTA 50 mm. Divisez le volume en 2 échantillons de volumes identiques (11 μl en théorie; pipettez la moitié et placez directement dans l eppendorf contenant le mélange phenol/chloro et agitez puis reposez sur glace! (les 5 groupes déposent chacun 11 µl). Sur la seconde partie qui reste dans l eppendorf d incubation ajoutez 1 µl de «Loading Buffer». (généralement 50 mm DTA avec colorants Xylène Cyanol et, Déposez Important: 1. Vos «pipettes» sont en théorie calibrées. Cependant considérez qu une pipette utilisée dans sa gamme de volumes («range») par un biologiste moléculaire chevronné affichera malgré tout une erreur de l ordre de 10% principalement lorsqu elle est utilisée à la limite inférieure de son «range». 2. N oubliez pas de «changer de tip» si vous manipulez des solutions différentes Pour la préparation d'un tampon TB (1x) ph 8,0 peser : 10,78 g (89 mm) TRIS (CAS# 37186), 5,50 g (89 mm) Acide borique (CAS# 11280), 0,58 g (2 mm) DTA disodium salt (CAS# 39761)Caractérisation du plasmide pk7d4-diy (BCCM #4282) par digestions de restriction et électrophorèse des fragments de restrictions. Identification de la taille et de la structure du plasmide. Travail de groupe (2-3) Groupe 1. Digestion de 200 ng du plasmide pk7d4-diy par XbaI Groupe 2. Digestion de 1,400 ng du plasmide pk7d4-diy par cori Groupe 3. Digestion de 100 ng du plasmide pk7d4-diy par BamHI Groupe 4. Digestion de 100 ng du plasmide pk7d4-diy par HindIII Groupe 5. Digestion de 100 ng du plasmide pk7d4-diy par XhoI 24

25 Le Séquençage d ADN (Sanger) N Toutefois notre chercheur ne va pas «commander» ces 2 amorces. Car n oublions pas que l objectif final est de séquencer les 2 brins (codant et matrice) d ADN de la Protease. t comme ce chercheur n a pas à sa disposition le matériel (et les finances) pour avoir recours au NGS («Next Generation Sequencing») il va commander 4 amorces dont les séquences sont représentées ci dessous. Nous allons voir le pourquoi de cette approche. Mais pour mieux la comprendre il est nécessaire que nous nous informions d avantage sur le clonage et le séquençage. Intéressons-nous d abord au séquençage d ADN selon la méthode développée par l équipe de Fred Sanger (Cambridge University UK; prix Nobel ) Regardez la vidéo et prenez des notes. C est très proche d une réaction PCR (utilise aussi une ADN polymérase). La seule chose à savoir c est que les dideoxynucleotides vont «bloquer» la réaction. t, nous allons enzymes de en tête nous ctrophorèse & eront une idée ne nzyme de s difficultés à i elle n est pas est pourquoi ases en 5 du nt qu à faire aux bases de 25

26 Le Séquençage d ADN (Sanger) N Toutefois notre chercheur ne va pas «commander» ces 2 amorces. Car n oublions pas que l objectif final est de séquencer les 2 brins (codant et matrice) d ADN de la Protease. t comme ce chercheur n a pas à sa disposition le matériel (et les finances) pour avoir recours au NGS («Next Generation Sequencing») il va commander 4 amorces dont les séquences sont représentées ci dessous. Nous allons voir le pourquoi de cette approche. Mais pour mieux la comprendre il est nécessaire que nous nous informions d avantage sur le clonage et le séquençage. Intéressons-nous d abord au séquençage d ADN selon la méthode développée par l équipe de Fred Sanger (Cambridge University UK; prix Nobel ) Regardez la vidéo et prenez des notes. C est très proche d une réaction PCR (utilise aussi une ADN polymérase). La seule chose à savoir c est que les dideoxynucleotides vont «bloquer» la réaction. 26

27 Le Séquençage d ADN (Sanger) Toutefois notre chercheur ne va pas «commander» ces 2 amorces. Car n oublions pas que l objectif final est de séquencer les 2 brins (codant et matrice) d ADN de la Protease. t comme ce chercheur n a pas à sa disposition le matériel (et les finances) pour avoir recours au NGS («Next Generation Sequencing») il va commander 4 amorces dont les séquences sont représentées ci dessous. Nous allons voir le pourquoi de cette approche. Mais pour mieux la comprendre il est nécessaire que nous nous informions d avantage sur le clonage et le séquençage. Intéressons-nous d abord au séquençage d ADN selon la méthode développée par l équipe de Fred Sanger (Cambridge University UK; prix Nobel ) Regardez la vidéo et prenez des notes. C est très proche d une réaction PCR (utilise aussi une ADN polymérase). La seule chose à savoir c est que les dideoxynucleotides vont «bloquer» la réaction. t essayez de savoir pour quelles raisons il a fait e choix d amorces? (Tentez de l expliquer) Tuyaux 1. Notre chercheur souhaite s assurer que les données de séquences pourront permettre un bon diagnostic VIH/SIDA. Pour cela il souhaite réaliser du séquençage type Sanger- Fluo «directement» sur le produit de PCR mais également sur des produits de PCR clonés dans un plasmide (et séquencer 100 «clones»). Remarque: Il dispose d un plasmide puc19 pour cloner le produit de PCR. 2. Notre chercheur qui n est pas un novice et sait qu une réaction de PCR peut toujours générer des «artefacts» et qu en séquençage Sanger la «lecture» des 20 premiers nucléotides est plutôt «ambiguë» ccaccagaag agagcttcag gtctggggta gagacaacaa ctccccctca gaagcaggag 2221 ccgatagaca aggaactgta tcctttaact tccctcaggt cactctttgg caacgacccc 2281 tcgtcacaat aaagataggg gggcaactaa aggaagctct attagataca ggagcagatg 2341 atacagtatt agaagaaatg agtttgccag gaagatggaa accaaaaatg atagggggaa 2401 ttggaggttt tatcaaagta agacagtatg atcagatact catagaaatc tgtggacata 2461 aagctatagg tacagtatta gtaggaccta cacctgtcaa cataattgga agaaatctgt 2521 tgactcagat tggttgcact ttaaattttc ccattagccc tattgagact gtaccagtaa 2581 aattaaagcc aggaatggat ggcccaaaag ttaaacaatg gccattgaca gaagaaaaaa cori G AATTC CTTAA G XbaI T CTAGA AGATC T 27

28 Le Séquençage d ADN (Sanger) Toutefois notre chercheur ne va pas «commander» ces 2 amorces. Car n oublions pas que l objectif final est de séquencer les 2 brins (codant et matrice) d ADN de la Protease. t comme ce chercheur n a pas à sa disposition le matériel (et les finances) pour avoir recours au NGS («Next Generation Sequencing») il va commander 4 amorces dont les séquences sont représentées ci dessous. Nous allons voir le pourquoi de cette approche. Mais pour mieux la comprendre il est nécessaire que nous nous informions d avantage sur le clonage et le séquençage. Intéressons-nous d abord au séquençage d ADN selon la méthode développée par l équipe de Fred Sanger (Cambridge University UK; prix Nobel ) Regardez la vidéo et prenez des notes. C est très proche d une réaction PCR (utilise aussi une ADN polymérase). La seule chose à savoir c est que les dideoxynucleotides vont «bloquer» la réaction. t essayez de savoir pour quelles raisons il a fait e choix d amorces? (Tentez de l expliquer) Tuyaux 1. Notre chercheur souhaite s assurer que les données de séquences pourront permettre un bon diagnostic VIH/SIDA. Pour cela il souhaite réaliser du séquençage type Sanger- Fluo «directement» sur le produit de PCR mais également sur des produits de PCR clonés dans un plasmide (et séquencer 100 «clones»). Remarque: Il dispose d un plasmide puc19 pour cloner le produit de PCR. 2. Notre chercheur qui n est pas un novice et sait qu une réaction de PCR peut toujours générer des «artefacts» et qu en séquençage Sanger la «lecture» des 20 premiers nucléotides est plutôt «ambiguë». 28

29 Le Séquençage d ADN (Sanger) Ke séquençage d ADN selon la méthode développée par l équipe de Fred Sanger (Cambridge University UK; prix Nobel ) lectrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant avec dideoxynucléotides marqués au souffre radioactif (exposition sur film photo et lecture manuelle) Une Station de Séquençage automatique (ABI-3700; basée sur l utilisation de dideoxynucléotides marqués avec 4 fluorochrome différents; lecture automatique) 29

30 Le Séquençage d ADN (Sanger) Toutefois notre chercheur ne va pas «commander» ces 2 amorces. Car n oublions pas que l objectif final est de séquencer les 2 brins (codant et matrice) d ADN de la Protease. t comme ce chercheur n a pas à sa disposition le matériel (et les finances) pour avoir recours au NGS («Next Generation Sequencing») il va commander 4 amorces dont les séquences sont représentées ci dessous. Nous allons voir le pourquoi de cette approche. Mais pour mieux la comprendre il est nécessaire que nous nous informions d avantage sur le clonage et le séquençage. 30

31 Infos diverses Les plasmides (ex puc19): Caractéristiques et utilisations (1/). Génétique / Biologie Moléculaire = utilisation de séquences Nucléotidiques (ADN/ARN) et/ou Peptidiques (Protéines) Recherche par mots clés Choix du format de visualisation Accession Number(s) Unique(s) Universel! t enfin la séquence complète Format FASTA Universel! «Features» Description du contenu 31

32 valuation 6GT SG (version A). Question 1. Le tableau 1 ci-dessous reprend les données obtenues par analyse de l électrophorèse en gel d agarose d un fragment généré par PCR ainsi que sa digestion par un enzyme de restriction Représentez le fragment de PCR en positionnant le site de restriction de l enzyme utilisé Sachant que toutes les digestions de restriction ont été réalisées à partir de 7 µl de la solution «mère» du fragment PCR et que l analyse de l électrophorèse du gel d agarose permet de quantifier la bande d une taille de 200 bp comme correspondant à 100 ng d ADN, quelle est la concentration de la solution «mère» du fragment PCR? Ce fragment est ensuite cloné «blunt end» au site SmaI du MCS du plasmide pstudent01 et les données obtenues par analyse de l électrophorèse en gel d agarose du plasmide contenant le fragment PCR après digestions de restriction sont reprises dans le tableau Représentez le plasmide et son insert PCR cloné en positionnant les sites de restriction des enzymes utilisés lors des digestions de restriction. Question Sachant qu un Génome X contient 30% de nucléotides à base azotée Adénine, quelles sont: Les proportions (%) respectives des bases azotées Thymine: _ Cytosine: _ et Guanine _? Les proportions (%) respectives des bases azotées de type Purines: _ Pyrimidines: _? Que vaut le rapport %AT sur %GC? _ 2.2. Sachant qu en première approximation (Wallace rule ) la température «d appariement» d un primer (amorce) de PCR peut-être estimée par la formule: (nombre G + C) x 4 + (nombre de A + T) x 2, le chercheur Z à commandé 2 amorces (séquences soulignées) pour tenter de réaliser une PCR sur la région du Génome X décrite ci-dessous. A quelle température d appariement doit-il programmer son appareil de PCR PTC-200 pour s assurer d une amplification optimale et pensez-vous (justifiez) que cette amplification sera efficace/effective? 5 AGTCGATGATCAGGCAGCTGCATGCCATACAGAGGAGCGCACTCGCTATGCGAGCTTGCTTATCACGAAG 3 3 TCAGCTACTAGTCCGTCGACGTACGGTATGTCTCCTCGCGTGAGCGATACGCTCGAACGAATAGTGCAAC 5 Upper Strand Primer = 5 GTCGATGATCAGGCAGCTGC 3 = 20 nucleotides G+C = 12 x 4 = 48 et A+T = 8 x 2 = 16 Melting T 64 C Lower Strand Primer = 5 TGATAAGCAAGCTCGCATAGCG = 22 nucleotides G+C = 11 x 4 = 44 et A+T = 11 = 22 Melting T 66 C Melting T = 64 C < 66 C PROs: Almost same melting T, starting with one G/C at 3 end and 3 in last 6 at 6 end, 18 in length & Genome X is A+T 60% vs. 40% G+C so at random a 18 nucleotides primer is 0,6 x 18 x 2 + 0,4 x 18 * 4 = 60 C. So even if there are some matching first 6 (1/4096) 64 C should work. BUT a step down approach 32 is recommended (e.g. 68 to

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