TD Biologie Cellulaire 2

Transcription

1 TD Biologie Cellulaire 2 Année Cycle cellulaire : cas particulier de la méiose alain.martoriati@univ-lille1.fr

2 Rappel sur le cycle cellulaire

3 Rappel sur le cycle cellulaire

4 Rappel sur la mitose

5 A) Début de prophase (7) B) Fin de prophase (3) C) Rupture de l enveloppe nucléaire et début de la pro-métaphase (9) D) Pro-métaphase (1) E) Fin de pro-métaphase (6) F) Métaphase (8) G) Anaphase (4) H) Télophase (5) I) Fin de mitose (2)

6 Technique d observation : immunofluorescence IF : anti tubuline Marquage ADN : Hoechst 33342

7 Les régulations du cycle cellulaire

8 Les régulations du cycle cellulaire

9 La méiose

10 MEIOSE AU COURS D UNE GAMETOGENESE ( exemple où 2n = 6 ) Prophase

11 MEIOSE AU COURS D UNE GAMETOGENESE ( exemple où 2n = 6 ) Prophase

12 MEIOSE AU COURS D UNE GAMETOGENESE ( exemple où 2n = 6 ) Prophase Métaphase Anaphase

13 MEIOSE AU COURS D UNE GAMETOGENESE ( exemple où 2n = 6 ) Prophase Métaphase Anaphase Télophase Première division : la division réductionnelle

14 MEIOSE AU COURS D UNE GAMETOGENESE ( exemple où 2n = 6 ) Prophase Métaphase Anaphase Télophase Première division : la division réductionnelle 1 Cellule 2 cellules diploïde haploïdes 2n = 6 n = 3

15 MEIOSE AU COURS D UNE GAMETOGENESE ( exemple où 2n = 6 ) Deuxième division : la division équationnelle Prophase

16 MEIOSE AU COURS D UNE GAMETOGENESE ( exemple où 2n = 6 ) Deuxième division : la division équationnelle Prophase Métaphase

17 MEIOSE AU COURS D UNE GAMETOGENESE ( exemple où 2n = 6 ) Deuxième division : la division équationnelle Prophase Métaphase Anaphase

18 MEIOSE AU COURS D UNE GAMETOGENESE ( exemple où 2n = 6 ) Deuxième division : la division équationnelle Prophase Métaphase Anaphase Télophase

19 MEIOSE AU COURS D UNE GAMETOGENESE ( exemple où 2n = 6 ) Deuxième division : la division équationnelle Prophase Métaphase Anaphase Télophase 2 Cellules 4 cellules haploïdes haploïdes n = 3 n = 3

20 BILAN DE LA MEIOSE ( exemple où 2n = 6 ) Première division : la division réductionnelle 1 Cellule 2 cellules diploïde haploïdes 2n = 6 n = 3

21 BILAN DE LA MEIOSE ( exemple où 2n = 6 ) Première division : la division réductionnelle Deuxième division : la division équationnelle 1 Cellule 2 cellules diploïde haploïdes 2n = 6 n = 3 2 Cellules 4 cellules haploïdes haploïdes n = 3 n = 3

22 La méiose La méiose a 2 conséquences essentielles: d une part elle aboutit à la formation des gamètes haploïdes, et d autre part elle engendre un énorme brassage génétique. Légendez la cellule ci-dessous (pour laquelle 2n = 4), puis faites effectuer la méiose à cette cellule, en dessinant les étapes essentielles permettant de comprendre le processus de réduction chromatique et les brassages chromosomiques et génétiques (jusqu à la formation des gamètes).

23 spermatogonie ovogonie réplication Crossing-over possibles spermatocyte primaire ovocyte primaire Crossing-over possibles spermatocyte secondaire Meiose I (division réductionnelle) ovocyte secondaire Meiose II (division equationnelle) premier globule polaire spermatide deuxième globule polaire différenciation spermatozoïdes ovule Brassage interchromosomique: ségrégation aléatoire des chromosomes au cours de la première division de meïose

24 4 gamètes possible (a) Crossing-over génotype parental génotype recombinant (b) Résultat du crossing-over génotype recombinant génotype parental Brassage intrachromosomique: recombinaison du génome par crossing-over en prophase I de méïose

25 Deux phases de méiose sont représentées. Les observations n ont pas permis de savoir si les chromosomes sont constitués d'une ou de deux chromatides dans chaque cas. En revanche, un marquage préalable permet de différencier les chromosomes d origine paternelle (noirs) et maternelle (blancs). A B A- A peut être une anaphase 1 B- A peut être une anaphase 2 C- B peut être une anaphase 2 D- B peut être une métaphase 1 E- En B, les chromosomes sont formés d'une seule chromatide

26 La cellule fécondable n a pas toujours achevé sa méiose situation variable d une espèce à l autre (Gilbert, Developmental Biology, 7 th edition 2003, d'après Austin, 1965)

27 L ovocyte de xénope : un modèle d étude de la méiose

28 La division méiotique femelle des vertébrés hormone de ponte 1ère étape cellules folliculaires AMPHIBIENS POISSONS LH hormone 2ème étape progestérone 17a,20bDP ovocyte maturation méiotique

29 Division méiotique - ovocyte de Xénope Phase S prémeiotique 1er blocage Induction hormonale 2 nd blocage 2-5 h 0,5 h 1,5 h Cycles Mitotiques Arrêt en Prophase I GVBD Métaphase I Métaphase II Progestérone I II III IV V VI Non compétents Compétents MII Ovocyte fécondable Ovogenèse

30 Intérêts du modèle ovocyte de Xénope Progestérone Prophase I MII Ovocyte fécondable phénomène biologique facilement observable morphologiquement

31 Intérêts du modèle ovocyte de Xénope Progestérone Prophase I MII Ovocyte fécondable Modèle de choix pour étudier la transition prophase 1 / Métaphase 2 assimilable à la transition G2/M lors de la mitose Grande quantité d ovocytes disponibles par femelle Grande taille des cellules, facile à manipuler Culture in vitro (maturation in vitro, utilisation d inhibiteurs) Cellule très robuste facile à microinjecter (stratégie anti-sens ou surexpression) Etude biochimique facilitée par la grande quantité de protéines par ovocyte (WB, purification) Caractérisation et Régulations du MPF

32 Régulation du MPF Cdc25 Wee1 Myt1 T14 Y15 T161 P P P Cyclin B pre- MPF inactive 1. Synthèse / dégradation de la cycline 2. T161 = phosphorylation activatrice (cyclin activating kinase : CAK) 3. T14/Y15 = phosphorylations inhibitrices (myt1 wee1 /5)

33 Activité du MPF au cours de la méïose P P P P Cycline B P Cycline B Cycline B P P Cycline B Pré-MPF MPF Cycline B Activité MPF Prophase I GVBD Métaphase I Métaphase II Temps

34 Le MPF et ses cibles T14 Y15 T161 P P P T161 P Cyclin B MPF inactive Cyclin B MPF active PROTEINES CIBLES Réorganisation du cytosquelette lamines : dépolymérisation de la lamina; vimentine : dépolymérisation des filaments intermédiaires cytoplasmiques; Eg5 : mise en place du fuseau et séparation des centrosomes NuMa : focalisation des pôles du fuseau mitotique; MAPs : changement de la dynamique des microtubules en mitose Réorganisation du métabolisme cellulaire histones et condensines : condensation des chromosomes; nucléoline : réorganisation du nucléole; ARN polymérases : inhibition de la transcription; Rab4 : inhibition du trafic vésiculaire Régulation de ses propres régulateurs : Myt1, wee1, CDC25

35 Reprise de la méiose Disparition de la tâche de maturation 1-1h30 après fécondation Amphimixie

36 TD Biologie Cellulaire 2 Année la méiose et sa régulation moléculaire alain.martoriati@univ-lille1.fr

37 De la progestérone à l activation du MPF???? progesterone membrane ovocyte T14 Y15 T161 P P P Cyclin B MPF inactive Cyclin B MPF active T161 P

38 Implication de la voie AMPc/PKA dans l activation du MPF?? Exercice 1

39 Implication de la voie AMPc/PKA dans l activation du MPF?? Rappel : voie AMPc/PKA Mécanisme d activation de la protéine kinase dépendante de l AMPc, PKA Toxine cholérique ATP 5 -AMP IBMX Adénylate cyclase AMPc phosphodiestérase C C R R inactif R R + C C actif

40 AMPc Prophase I Prophase I Prophase I Prophase I Toxine cholérique IBMX C PKA AC AMPc PKA PDE AMPc PKA PKA progestérone La progestérone induit une chute d AMPc et de l activité PKA nécessaire et suffisante pour activer le MPF Métaphase II PDE Prophase I R Prophase I AMPc PKA PKA

41 De la progestérone à l activation du MPF???? progesterone membrane ovocyte camp PKA T14 Y15 T161 P P P Cyclin B MPF inactive Cyclin B MPF active T161 P

42 L activation du MPF dépendante de la synthèse protéique?? Exercice 2

43 L activation du MPF dépendante de la synthèse protéique?? ovocyte en prophase +/- Inhibiteur de synthèse protéique (cycloheximide : CHX) Ajout de PG Suivi de maturation pg /- chx pg /- chx

44 SDS-page Western Blot

45 PKA en amont ou en aval de la synthèse protéique?? CHX Ajout de PG ovocyte en prophase Suivi de maturation CHX R ou PDE ovocyte en prophase Suivi de maturation Ajout de PG ovocyte en prophase Suivi de maturation R ou PDE ovocyte en prophase Suivi de maturation pg chx R/PDE

46 De la progestérone à l activation du MPF progesterone membrane ovocyte camp PKA Synthèse protéique T14 Y15 T161 P P P Cyclin B MPF inactive Cyclin B MPF active T161 P

47 Exercice 3 La synthèse protéique pour l activation du MPF

48 La stratégie antisense (par oligonucleotides)

49 La synthèse protéique pour l activation du MPF Exercice 3 contrôle Mos anti-sense contrôle Mos anti-sense contrôle Mos anti-sense

50 De la progestérone à l activation du MPF progestérone membrane ovocyte camp PKA? Synthèses protéiques Mos ERK MAPK T14 Y15 T161 P P P Cyclin B MPF inactive Cyclin B MPF active T161 P

51 L activation du MPF dépendante de la synthèse protéique?? Exercice 4

52 L activation du MPF dépendante de la synthèse protéique?? Exercice Histone H1 % of GVBD 50 3 P-Tyr Cdc2 Cyclin B1 25 Mos Time (hrs) P-MAPK + Pg Prophase Control CycB Oligos Mos anti sens Mos anti sens + CycB Oligos

53 De la progestérone à l activation du MPF progestérone membrane ovocyte camp PKA? Synthèses protéiques Mos Cyclin B ERK MAPK T14 Y15 T161 P P P Cyclin B MPF inactive Cyclin B MPF active T161 P

54 Voie de transduction Progestérone activant le MPF progesterone camp PKA Synthèse protéïque Mos Cyclin B MEK MAPK P P Cyclin B MPF amorce Néo complexes actifs ET/OU P P P Cyclin B2 pre-mpf Myt1 Cdc25 Auto-amplification P Cyclin B2 MPF Activation du pré-mpf inactive

55 Résumé : Rôle et activité de Myt 1 dans les ovocytes en prophase 1 Cyclin B P P P P Cyclin B Cyclin B2 Myt 1 est responsable de l accumulation de pré-mpf dans les ovocytes en prophase 1 en ciblant les néo-complexe cyclinb/cdc2

56 Résumé : Rôle et régulation de Myt 1 dans les ovocytes au cours de la reprise de méiose Synthèse forte induite par progestérone Cyclin B P Cyclin B P Cyclin B Myt1 P P P Cyclin B2 Mos P P P Cyclin B2 Stock de pré-mpf Cdc25 Auto-amplification P PP Cdc25 P Cyclin B MPF