Apport des tests d immunobiologie au diagnostic et au suivi des connectivites
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- Céline Lemieux
- il y a 6 ans
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1 Apport des tests d immunobiologie au diagnostic et au suivi des connectivites Prof. F. Mascart 19/09/2011
2 Polyarthrite rhumatoïde Syndrome de Sjögren sclérodermie Syndrome antiphospholipides LED Connectivite mixte/ overlap syndrome Poly-dermato myosite
3 TESTS INFLAMMATOIRES Dosage d une protéine inflammatoire - CRP - fibrinogène - orosomucoïde - haptoglobine - a1 anti-trypsine Mesure de la vitesse de sédimentation Soit mesure de la VS Soit dosage du fibrinogène (Règle de cumul) dosage permis: max. 2 (règle de cumul)
4 Caractéristiques d une protéine «inflammatoire» idéale - concentration influencée uniquement par la réaction inflammatoire - concentration ne dépend pas de l étiologie de l inflammation - cinétique d apparition rapide - cinétique de disparition rapide - augmentation significative même pour réaction inflammatoire modérée - dosage précis, rapide, pas trop cher CRP = C reactive protein
5 CRP = C reactive protein Normalement présente à l état de traces dans le sérum Augmentation de synthèse 6 heures après le début de la réaction inflammatoire Demi-vie très courte (de 8 à 12 h) bon monitoring de l efficacité d un traitement Dosage précis, rapide, peu onéreux
6 Concentrations très élevées de CRP (> 10 mg/dl): - infection bactérienne sévère - nécroses cellulaires (traumatisme majeur, infarctus du myocarde) - vasculite systémique!!! Une valeur normale de CRP n exclut pas une inflammation: - certaines connectivites (LED) - rectocolite ulcéro-hémorragique - ostéoarthrite
7 La vitesse de sédimentation Mauvais reflet d une inflammation aiguë Bon indicateur d un processus pathologique : Causes de «fausses» élévations de la VS: - immunoglobuline monoclonale - cryoglobuline - agglutinines froides - anémie Causes de VS «artificiellement» basses: - polycythémie - hyperleucocytose
8 CRYOGLOBULINE Immunoglobuline sérique qui précipite en-dessous de 37 C Réaction réversible Signes cliniques: * signes cutanés (purpura vasculaire, nécrose distale, urticaire) * syndrome de Raynaud * arthralgies * glomérulonéphrite * manifestations neurologiques Peut interférer avec la recherche d auto-anticorps
9 CRYOGLOBULINE Classification en fonction de l analyse immunochimique type I : Ig monoclonale d un seul isotype pathologies malignes du lymphocyte B type II : cryoglobuline mixte: connectivites 1 Ig monoclonale + 1 Ig polyclonale (2 isotypes =) infections chroniques anémies hémolytiques glomérulonéphrite post strepto sarcoïdose cryoglobulinémie essentielle type III : cryoglobulinémie mixte polyclonale processus inflammatoires
10 Mise en évidence d une cryoglobuline (prélèvement dans un tube préchauffé à 37 C) transfert au laboratoire à 37 C formation du caillot à 37 C 1 tube à 4 C 1 tube à 37 C comparaison des tubes tous les jours pendant 7 jours recherche d un précipité dans le tube maintenu à 4 C Précipité - précipité + réversibilité à 37 C cryo - cryo + quantification (cryocrite) caractérisation - lavage du précipité - dissolution à 37 C - électrophorèse
11 * Auto-anticorps dirigé contre le fragment Fc des immunoglobulines IgG * IgM - (IgG - IgA) LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE LE FACTEUR RHUMATOÏDE * Mise en évidence: test au latex: sensibilité ++ test de Waaler-Rose: spécificité (facturation au patient 5 E) (tests Elisa)
12 Mise en évidence du facteur rhumatoïde IgM agglutinant Test de Waaler-Rose (1940) Basé sur la reconnaissance des immunoglobulines animales par le FR. Les FR (IgM pentamériques) agglutinent les GR de mouton sensibilisés par des IgG de lapin. Sensibilité : 60% Spécificité : 80% /40 1/80 1/160 1/320 1/640 UI/ml Dilutions
13 Mise en évidence du facteur rhumatoïde IgM agglutinant Test au latex Basé sur la reconnaissance des immunoglobulines humaines par le FR. Les FR (IgM pentamériques) agglutinent des particules de latex sur lesquelles ont été fixées des IgG humaines. L agglutination est quantifiée par néphélométrie. Un rayon laser traverse le tube. La diffraction de la lumière par les particules est mesurée à la sortie. Plus il y a de précipité Ac/Ag, plus il y aura de signal sur le photomultiplicateur (appareil qui mesure la diffraction). Sensibilité : 75% Spécificité : 70%
14 Mise en évidence du facteur rhumatoïde IgG / IgA NON agglutinant Test ELISA Permet de rechercher les 3 isotypes : mise en évidence des FR de type IgM mais aussi IgA ou IgG
15 Le FR n est pas le marqueur idéal : Inconvénients du FR : Sensibilité du FR IgM agglutinant de ~70% (selon la technique) => FR négatif n exclut pas une PR ~30 % des PR sont dites "séronégatives» Le FR peut être négatif au début (50% des patients) puis se positiver après quelques mois d évolution Spécificité du FR IgM agglutinant de ~70% (selon la technique) => FR positif n implique pas PR La spécificité du WR est meilleure que celle du latex Sujet normal (<65 ans) 1-10 % Sujet normal (>65 ans) 7-25 % Gougerot-Sjögren % LED % Infections bactériennes % Infections virales % Hépatites chroniques, cirrhose %
16 LE FACTEUR RHUMATOÏDE Intérêt pronostique - Dans la PR, des titres élevés de FR indiquent souvent une forme sévère de mauvais pronostic: affection plus évolutive arthrite plus érosive manifestations extra-articulaires - Au cours du temps, les titres varient peu en fonction de l activité de la maladie: pas de dosage fréquent
17 POLYARTHRITE RHUMATOÏDE IgG anti CCP (cyclic citrunilated peptide) Ac anti-kératine >< stratum corneum Antigène reconnu : la filaggrine Epitope majeur: la citrulline Détection optimale des Ac par ELISA peptides cycliques citrullinés
18 Unités 2000 POLYARTHRITE RHUMATOÏDE Anti CCP (Eurodiagnostica RT) sensibilité: % spécificité: 99 % positif 50 faiblement pos, à retester 0 négatif Arthroses Fibromyalgies Hépatite C Hypergamma Ker+/CCPneg Lupus PR Sjogren
19 Rheumatoid factor (Latex/WR) POLYARTHRITE RHUMATOÏDE Anti CCP sont les marqueurs les plus spécifiques de la PR Place du FR? Anti CCP and Rheumatoid factor anti CCP (U/ml) Rheumatoid factor : Latex r spearman = (p = ) Rheumatoid factor : WR r spearman = (p = NS)
20 VS POLYARTHRITE RHUMATOÏDE AVANTAGE MAJEUR DES ANTI-CCP Apparition très précoce, parfois plusieurs années avant les signes cliniques traitement précoce A RECHERCHER PRIORITAIREMENT DANS LES FORMES DEBUTANTES ET SERONNEGATIVES Anti CCP and VS Les anti-ccp sont associés à des formes sévères de PR (érosions 10 X plus fréquentes) Anti CCP (U/ml) VS r spearman = (p= NS)
21 LES ANTICORPS ANTI-NUCLEAIRES Polyarthrite rhumatoïde Syndrome de Sjögren sclérodermie Syndrome antiphospholipides LED Connectivite mixte Poly-dermato myosite
22 LES ANTICORPS ANTI-NUCLEAIRES Le dosage spécifique de chaque anticorps potentiellement utile au diagnostic d une connectivite est à l heure actuelle trop cher Anti-DNA, anti-nucléosome, anti-histone, anti-sm, anti-rnp, anti-ss-a, anti-ss-b, anti-scl-70, anti-pm-scl, anti-jo1, anti-centromères, anti-ribosomes Prescription spécifique d un anticorps en fonction de l hypothèse diagnostique?
23 Suspicion clinique de LED? / connectivite mixte? / polyarthrite rhumatoïde..? et/ou de syndrome de Sjögren..? de dermatomyosite.? SCREENING: recherche et titration des anticorps anti-nucléaires LED PR Sjögren Connectivite mixte Sclérodermie Syndrome de Crest IDENTIFICATION DE LA SPECIFICITE ANTIGENIQUE Ac antinucléaire Anti-DNA ds Anti-nucléosomes Anti-histones Anti-SS-A Anti-SS-B Anti-RNP Anti-Scl-70 Anti-centromère Anti-Sm
24 SUSPICION DE CONNECTIVITE Recherche d un anticorps anti nucléaire Titration Identification À cocher d emblée cf règle diagnostique Recherche de signes d activation du complément Biologie inflammatoire? VS et CRP IgG IgA IgM recherche d une cryoglobuline
25 DETECTION par immunofluorescence sur cellules Hep2 Technique simple, rapide Test SENSIBLE: LED exceptionnel en l absence de FAN Test NON SPECIFIQUE: - pas de spécificité antigénique - pas de spécificité clinique Pas de valeur pronostique Titrage de l anticorps Description de l image ANTICORPS ANTI-NUCLEAIRES
26 homogène moucheté SS-A nucléolaire
27 Anticorps anti-nucléaire: absence de spécificité clinique Maladies auto-immunes connectivites vasculites hépatites chroniques actives cirrhose biliaire primitive thyroïdites Maladies infectieuses: viroses (hépatites, MNI) Néoplasies Situations physiologiques femmes enceintes personnes âgées Médicaments
28 ANA POSITIVITY (%) in healthy individuals 10 8 Titre 1/ Titre 1/ ans
29
30 En résumé. Screening par IFI sur cellules HEP2 (HEP2000) NEGATIF POSITIF (> 1/80) - titre - image identification Ags de la chromatine Ags nucléaires solubles (ENA)
31 Screening par IFI sur cellules HEP2 (HEP2000) Deux images intéressantes: 1. Ac anti-centromères Marqueur sérologique du syndrome de CREST: - calcinose sous-cutanée - phénomène de Raynaud - dysmotilité oesophagienne - sclérodactylie - télangiectasies Présent aussi dans: - 25 % des phénomènes de Raynaud primaires - cirrhose biliaire primitive - ( LED, Sjögren, connectivite mixte) % des donneurs de sang
32 Screening par IFI sur cellules HEP2 (HEP2000) Deux images intéressantes: 2. Les AC anti-jo-1!! Fluorescence cytoplasmique anti-jo-1 marqueur de sévérité des polymyosites primaires fine fluorescence mouchetée du cytoplasme avec condensation des granules autour du noyau
33 Identification des Ac. antinucléaires Antigènes de la chromatine Antigènes nucléaires solubles (ENA) LED Anti-DNA ds (anti-histones) anti-nucléosomes Anti-RNP Anti-Sm Anti-SS-A Anti-SS-B Anti-Scl-70 MCTD LED Sjögren sclérodermie anti-jo-1 Anti-PMScl Anti-Ku Anti-SL Anti-Mi2.. Poly/ dermatomyosite
34 Anticorps anti-nucléaire: IDENTIFICATION DE CERTAINES SPECIFICITES ANTIGENIQUES 60% Pourcentage d anticorps antinucléaires pour lesquels l identification est positive 50% 40% 30% 20% 10% 0% 1/80 et 1/160 1/320 et 1/640 > 1/640
35 DsDNA Abs (IU/ml) Anti-DNA ds LED Autres Vasc divers connectivites (infections)
36 Anti-DNA ds La sensibilité pour le diagnostic de LED est moyenne: ~ 65% La présence d anti-dnads circulants est souvent un signe de gravité, surtout à titre élevé (atteinte rénale) Cependant, on trouve rarement des anti-dna circulants dans les formes neurologiques de LED La spécificité pour le diagnostic de LED est très bonne mais uniquement à titre élevé
37 Anti-DNA ds IF sur Crithidia Luciliae: hémoflagellé voisin des trypanosomes kinétoplaste = mitochondrie ADN bicaténaire circulaire natif
38 Intérêt du suivi des taux d anticorps anti-ds DNA? Home made (AU) Varielisa(UI/ml) Elia (IU/ml) /97 01/98 02/98 11/99 04/00 01/01
39 Intérêt du suivi des taux d anticorps anti-ds DNA? La diminution du titre des Ac anti-dna est un élément de pronostic favorable L absence de diminution n est pas nécessairement un mauvais signe Si le titre d Ac a diminué, la ré-apparition des Ac annonce souvent une rechute Intérêt de la mise en évidence de signes d activation du complément
40 Ac. Anti-histones Seul Ac anti-nucléaire du lupus induit par les médicaments: isoniazide anti-hypertenseurs (bêta bloquants) anti-arythmiques anti-épileptiques phénothiazines positif dans 70-96% des lupus induits absence de spécificité: LED (18-50%) polyarthrite rhumatoïde (70-96%) arthrite juvénile (10-50%) cirrhose biliaire primitive (28%).
41 Anti-nucléosomes NUCLEOSOME = complexe ADN-histone < compactage de la chromatine NB: pour tenir dans le noyau, la chromatine est repliée grâce plusieurs niveaux de compactage
42 Anti-nucléosomes * Présence plus précoce de ces anticorps / anti-adn ds dans certains LED + 70 à 80 % des LED association avec la néphrite lupique * Moindre spécificité / anti-adn ds cf + LED sclérodermie MCTD induction par certains médicaments * Recherche par Elisa Anti-ADN ds Anti-histones Anti-nucléosomes
43 Ac. Anti ENA = «extractible nuclear antigens» Antigènes solubles dans une solution saline SERUM Corrélations cliniques établies entre: SERUM - la présence d anticorps contre certains de ces antigènes et - un tableau clinique particulier
44 Identification / séra de référence Sérum X? RNP + Sérum Y?
45 Anti- ENA: corrélations cliniques Anti- LED MCTD Sjögren Sclérodermie Sm + RNP SS-A SS-B Scl !! Techniques plus sensibles: - Elisa - Dot blot - Western blot..
46 En résumé. Screening par IFI sur cellules HEP2 (HEP2000) NEGATIF POSITIF (> 1/80) (règle diagnostique) - titre - image identification - anti-dnads / nucléosomes - Anti-ENA - Anti-RNP - Anti-SS-A et SS-B - Anti-Sm - Anti-Scl-70 - anti-nucléosomes - anti-histones - Anti-Jo-1 - Anti-histones - Anti-PMScl - Anti-Ku - Anti-SL - Anti-Mi2..
47 Polyarthrite rhumatoïde Syndrome de Sjögren sclérodermie Syndrome antiphospholipides LED Connectivite mixte Poly-dermato myosite
48 ET LES ANTICORPS ANTI-PHOSPHOLIPIDES? SYNDROME ANTI-PHOSPHOLIPIDES Définition: au moins 1 critère clinique et 1 critère biologique Clinique: 1) 1 ou plusieurs épisodes de thromboses artérielles ou veineuses ou des petits vaisseaux, confirmés par critères objectifs 2) complications obstétricales : - > 3 fausses couches < 10 ème sem - 1 ou plusieurs morts fœtales < 10 ème sem - 1 ou plusieurs naissances prématurées < 34 sem Biologique: 1) anticoagulant lupique au min. 2 fois détecté > 3 mois d intervalle 2) IgG et/ou IgM anti-cardiolipine titre moyen ou élevé min 2 fois détecté > 3 mois 3) IgG et/ou IgM anti b2 glycoprotéine I min 2 fois détecté > 3 mois N.B. - syndrome le plus souvent associé à un LED - occasionnellement, syndrome anti-phospholipide primaire, avec parfois des anti-dna
49 Les anticorps anti-phospholipides Ac >< phospholipides 80% Anti-coagulant lupique 20% Anti-cardiolipine Anti-phosphatidylsérine Anti-Beta2-GPI (beta 2 glycoprotéine I) protéine de liaison des phospholipides cible majeure des Ac anti-phospholipides Risque plus élevé de thrombose
50 L ANTICOAGULANT LUPIQUE Test fonctionnel de coagulation qui mesure la capacité des phospholipides à inhiber la conversion de la prothrombine en thrombine La réponse «anticoagulant lupique positif» se base sur les critères suivants: test de coagulation dépendant des phospholipides prolongé (aptt) absence de correction de ce temps prolongé quand on mélange le plasma du patient à un plasma normal pauvre en plaquettes (donc inhibiteur +) prolongation moindre de l aptt lorsqu on ajoute un excès de phospholipides exclusion d autres anomalies de la coagulation
51 IgG anti Cardiolipin (GPL - U/ml) IgG anti Cardiolipin Controls APS Various Infections Autoimmune Dis. LA neg LA pos
52 Anti Beta2 GPI IgG Anti Beta2 GPI IgG Anti Beta2 GPI IgG Anti Beta2 GPI IgG Les IgG anti-b2 GPI 100 Syndrome anti-phospholipides INFECTIONS 10 1 INOVA EuroImmun BIORAD PHADIA The Binding-Site 100 AUTOIMMUNE DISEASES INOVA EuroImmun BIORAD PHADIA The Binding-Site 1 INOVA EuroImmun BIORAD PHADIA The Binding-Site 100 VARIOUS (conditions NOT Related to thrombotic events) 10 1 INOVA EuroImmun BIORAD PHADIA The Binding-Site
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