Couplage Chromatographie liquide Spectrométrie de masse (LC - MS)

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Éloïse Godin
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1 Couplage Chromatographie liquide Spectrométrie de masse (LC - MS) Dr. El Morhit

2 Plan Introduction Principe de fonctionnement Prélèvement Injection & analyse Schéma du système Types d applications Conclusion + multimédia

3 Principe HPLC : (High Performance Liquid Chromatography) Sert à séparer les constituants d un mélange complexe MS : (Mass Spectrometry) Sert à caractériser les molécules du mélange à partir de la mesure de leur masse moléculaire

4 Prélèvement d échantillon Mélange de produits en solution

5 Injection et analyse Injecteur Colonne

6 Intensité Exemple de chromatogramme 100 % Temps

7 Schéma du système SOLVANTS POMPE INJECTEUR COLONNE DETECTEUR Bac à solvant Dégaseur à vide Pompe Passeur automatique d échantillon Compartiment à Colonne Détecteur

8 Choix de solvants Les solvants utilisés pour la séparation doivent répondrent à plusieurs critères : x Solubiliser les composés à analyser x Dégazage de solvant x Permettre une bonne séparation x Ne pas masquer ou inhiber le signal à mesurer

9 Choix des pompes Appareillage de la pompe Introduction à la pompe quaternaire La pompe quaternaire est constituée : 1. D un bac à solvant, 2. D un dégazeur à vide 3. D une pompe à gradient à 4 voies. La pompe à gradient à 4 voies se compose : 1. D une vanne proportionnelle rapide 2. D un ensemble pompe. Présentation générale de la pompe quaternaire La pompe quaternaire est une pompe à : 1. 2 voies Solvent Cabinet Degasser Pump 2. 2 pistons Ensemble pompe permet le dosage du solvant et le transfert et peut produire une pression pouvant atteindre 400 bars. Ensemble pompe comprend : 1. Une tête de pompe avec 2. un clapet d entrée et un clapet de sortie 3. Un amortisseur 4. Un clapet de purge

Principe de fonctionnement des pompes Le liquide issu de la bouteille de solvant s écoule à travers le dégazeur jusqu à la vanne de gradient multivoie et, de la, jusqu au clapet d entrée.

10 Principe de fonctionnement des pompes Le liquide issu de la bouteille de solvant s écoule à travers le dégazeur jusqu à la vanne de gradient multivoie et, de la, jusqu au clapet d entrée. L ensemble se compose de 2 pompes à pistons à peu près identiques. Les deux pompes à pistons comportent une commande par activateur et une tête de pompe avec un piston animé d un mouvement alternatif. Un moteur entraîne les 2 actionneurs de pistons dans des sens opposés. Les pignons des commandes par activateurs ont des circonférences différentes et le 1 piston se déplace 2X plus vite que le 2 piston. Le solvant pénètre dans la tête de pompe près du point mort inférieur et en sort près du point mort supérieur. Le 1 piston déplace un volume de µl, suivant le débit. L entré de la 1 pompe est reliée au clapet d entrée dont l ouverture ou la fermeture est commandé par le processeur pour permettre l admission de solvant dans la première pompe à piston. La sortie de la 1 pompe à piston est reliée à l entrée de la deuxième pompe à piston par l intermédiaire du clapet de sortie et de l amortisseur. La sortie de l ensemble clapet de purge est reliée au système chromatographique qui suit.

11 Propriétés des pompes Débit entre 10µL/min et 1mL/min pour LC/MS «classique» Débit fiable et constant. Faible volume mort. Résistant aux solvants, acides, bases. Résistant à haute pression

12 Schéma d une tête de pompe

13 Schéma des différentes têtes de pompes HPLC

14 Choix de l injecteur Propriétés de l injecteur Large gamme de volumes injectables Reproductibilité du volume injecté Automatisation Capacité à prélever dans des flacons de tailles diverses (petits échantillons)

15 Le système d injection

16 Choix de la colonne de séparation Propriétés de la colonne Il existe un grand nombre de type de colonne (diamètre, longueur, nature de la phase stationnaire ) Chacun de ces paramètres est à choisir en fonction de la quantité d échantillon, de la composition du mélange à analyser 150mm 100mm 50mm

17 Vanne de commutation de la colonne La vanne peut sélectionner la colonne 1 ou la colonne 2. L autre colonne est hors circuit. La commutation doit être effectuée quand il n y a pas d écoulement et que la pression est nulle.

18 Choix du détecteur Propriétés du détecteur Sensible Quantitatif Informatif Simple d utilisation

19 Comparaison des détecteurs Type Versatilité Sélectivité Sensibilité Linéarité Information Simplicité Réfractomètre Fluorimètre UV Barrette de diodes MS

20 Le Spectromètre de Masse Principe Source Analyseur Détecteur Domaines d application Choix technique

21 Principe Technique d analyse basée sur la mesure du rapport m/z (masse/charge) des ions formés Dans une source. Il est donc nécessaire de former des ions!!!

22 Les principales sources d ionisation MultiMode Electrospray APCI APPI APCI ESI HPLC-Chip MS APPI

23 HPLC + + La source Electrospray N 2 Ionisation Nébulisation Transfert des ions N 2 séchage + + SM N 2

24 HPLC La source APCI Nébulisation N Ionisation par aiguille Corona + Transfert des ions N 2 séchage N 2 SM

25 Mécanisme de l ionisation chimique (APCI) Analyte containing aerosol Heat Charge transfer to analyte Vapor Charged reagent gas formed Analyte ions

26 HPLC La source APPI Nébulisation N 2 h Ionisation par lampe Transfert des ions N 2 séchage N 2 SM

27 Electrospray Ions Nebulizer (gas shown in red) V Heated nitrogen drying gas Solvent spray + + Dielectric capillary entrance Evaporation Rayleigh Limit Coulomb Explosion Evaporation Analyte Ion Mécanisme d ionization d Electrospray -APPImorhit_med@yahoo.fr GSM: Dr. EL MORHIT M.

28 Masse moléculaire Comparaison des sources Protéines 1000 Peptides ESI APPI HAP 100 APCI Polarité

29 S/N Sensibilité relative des 3 modes ESI APPI APCI Carbofuran Mexacarbate Diuron Monuron H 3 C N H O O O CH 3 CH 3 H 3 C C H 3 N CH 3 CH 3 O H 3 C NH O H 3 C O N CH 3 Cl Cl Cl H N OH CH 3 N CH3

produite par l'addition ou perte d'un proton, cation, anion ou électron.

30 Analyseur Principe d analyseur Un analyseur de masse mesure des ions de la phase gazeuse avec respect en ce qui concerne leur rapport: la masse sur la charge (m/z), où la charge est produite par l'addition ou perte d'un proton, cation, anion ou électron. L'addition de la charge permet à la molécule d'être affecté par le champ électrique donc autoriser sa mesure de masse.

31 Analyze de masse tandem Q1 (Quadrupole de parcour): est utilisé pour parcourir à travers un m/z préréglé aligné et sélectionné un ion d'intérêt. Q2 (Cellule de la Collision): concentre et transmet les ions en introduisant un gaz de la collision tel qu'azote dans le chemin du vol de l'ion sélectionné. Q3 (Quadrupole d analyse): sert à analyser les ions du fragment produit dans la Cellule de la Collision (Q2). Un ion choisi de la masse de précurseur est choisi du Q1 et la cellule de la collision Q2 produit des ions de fragment. Les ions de fragment sont alors analysés par Q3.

32 Applications Chimie analytique : la caractérisation et l'analyse structurale, la chimie combinatoire, etc. Analyse Agroalimentaire et Environnementale : Analyse de l'eau, du sol, recherche de pesticides, polluants, etc. Pharmaceutique : Recherche d'impuretés, caractérisation structurale, analyse métabolique, etc. Métabolisme / Toxicologie :Etude du métabolisme, détection de drogues, quantification, identification de métabolites, etc. Contrôle qualité : Contrôle qualité d'oligonucléotides, recherche d'impuretés, Protéines recombinantes, etc.

33 Conclusion Simplification et accélération de la préparation de l échantillon Réduction du temps d analyse Automatisation plus facile Questions?

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