Simplexa EBV Standards de dosage
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- Patrick Desroches
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1 Simplexa EBV Standards de dosage RÉF MOL2410 Rév. C Les standards de dosage Simplexa EBV sont destinées à établir une courbe de référence avec le test Simplexa EBV sur l'integrated Cycler de 3M. Pour diagnostic in vitro APPLICATION Les standards de dosage Simplexa EBV de FOcus Diagnostics sont destinées à établir une courbe de référence avec le test Simplexa EBV sur l'integrated Cycler de 3M. MATÉRIELS FOURNIS La trousee de standards de dosage Simplexa EBV de Focus Diagnostics contient suffisamment de produits pour deux réactions. Composant du kit Standard de dosage 1 du Simplexa EBV (QS-1) Standard de dosage 2 du Simplexa EBV (QS-2) Standard de dosage 3 du Simplexa EBV (QS-3) Standard de dosage 4 du Simplexa EBV (QS-4) Standard de dosage 5 du Simplexa EBV (QS-5) Description du kit de standards de dosage (Quantification Standard : QS) RÉF Standards de dosage de Simplexa EBV de Focus Diagnostics ( RÉF n MOL2410) Nombre de tubes par kit Réactions par flacon Volume (µl) pour un flacon MOL µl MOL µl MOL µl MOL µl MOL µl Description du composant MATÉRIELS NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNIS 1. Simplexa EBV ( RÉF. MOL2400) 2. Integrated Cycler de 3M avec le logiciel Integrated Cycler Studio version 3.0 ou plus récente 3. Universal Discs (Disques universels) utilisables sur l'integrated Cycler de 3M 4. Laminage de couverture d'un disque universel 5. a Système Roche MagNA TM Pure LC et consommables associés. 6. a Kit d'isolement d'acide nucléique total Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche, num. cat ) 7. b Appareil biomérieux NucliSENS easymag avec consommables et réactifs associés 8. b Pipette multicanaux Biohit/bioMerieux 9. b Plaque de micropuits ELISA 10. Micropipette(s) monocanal, multicanaux et/ou à répétition ayant une plage de précision de 1 à 10 µl, 10 à 100 µl et 100 à µl 11. Congélateur (dégivrage manuel) à -10 C à -30 C (pour stockage des composants congelés du kit) 12. Réfrigérateur à 2-8 C (pour composants du kit et normes de référence décongelés) 13. Enceinte de sécurité (hotte à flux laminaire) pour les extractions 14. Microcentrifugeuse 15. Vortex 16. Embouts antiaérosols, stériles, jetables, sans ARNase/ADNase de micropipetteur. 17. Tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml en polypropylène et portoirs (des tubes sans ARNase/ADNase sont recommandés mais non exigés). 18. Gants à usage unique, non poudrés.
2 Simplexa EBV Quantitation Standards Page Eau sans nucléase (utilisée au cours de l'extraction et comme Contrôle sans matrice [NTC]) 20. Portoirs de glacière pour tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml a À utiliser avec la méthode d'extraction Roche MagNA Pure LC b À utiliser avec la méthode d'extraction biomerieux easymag DURÉE DE CONSERVATION ET MANIPULATION 1. Conserver les standards de référence à une température comprise entre -10 et -30 C (ne pas utiliser de congélateur sans givre). 2. Après une première utilisation, conserver les standards de référence décongelées à une température comprise entre 2 C et 8 C pendant un maximum de cinq (5) jours. 3. N'utilisez pas les standards de reférence au-delà de leur date de péremption. MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONS 1. Pour diagnostic in vitro. 2. Tous les produits d'origine humaine doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Les matériaux sources d'où proviennent ce produit ont été testés à la recherche de l'antigène de surface de l'hépatite B, des anticorps anti-hépatite C et anti-vih-1/2 (SIDA) avec des méthodes homologuées par la FDA et sont apparus négatifs. Cependant, comme aucune méthode de test connue ne peut offrir une garantie à 100 % que des produits dérivés du sang humain ne transmettront pas ces agents infectieux (ou d'autres), tous les contrôles, échantillons de sérum et équipements rentrant en contact avec ces échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux et décontaminés ou éliminés en utilisant les précautions concernant les risques biologiques. Les CDC et les National Institutes of Health préconisent que les agents potentiellement pathogènes soient manipulés au niveau de biosécurité 2. 1,2 3. Portez un équipement individuel de protection comme (mais non limité à) des gants et une blouse de laboratoire lors de la manipulation des réactifs du kit. Lavez-vous soigneusement les mains quand vous avez fini le test. 4. Ne pas pipeter à la bouche. 5. Ne pas fumer, boire, manger, manipuler des lentilles de contact ou se maquiller dans les zones où des réactifs de kits et/ou des échantillons d'origine humaine sont utilisés. 6. Éliminez les standards de référence non utilisées conformément à la réglementation locale, de l'état et fédérale. 7. La contamination des échantillons de patients ou des réactifs peut aboutir à des résultats erronés. Utilisez des techniques respectant les règles d'asepsie. 8. Pipetez et manipulez les standards avec prudence pour éviter de mélanger les standards de référence de puits contigus. 9. Utilisez des techniques de pipetage correctes et conservez le même schéma de pipetage tout au long de la procédure pour garantir l'obtention de valeurs optimales et reproductibles. 10. Ne substituez pas ou ne mélangez pas des standards de référence de différents lots de kits ou avec des produits d'autres fabricants. 11. N'intervertissez pas les bouchons des tubes. Cela pourrait provoquer une contamination et compromettre les résultats des tests. 12. Ne réutilisez pas des Universal Disc (disques universels) qui ont été déjà exposés aux échantillons de patients ou à des réactifs. 13. Éliminez le disque utilisé sans détacher ou enlever l'adhésif qui le recouvre. MODE D'EMPLOI C. ZONE D'EXTRACTION DES STANDARDS DE DOSAGE Travaillez dans une zone dédiée à l'extraction. La préparation des standards de dosage pour l'extraction doit être effectuée dans une enceinte de sécurité. Extraction selon la méthode Roche MagNA Pure LC 1. Procédez à l'extraction des standards de dosage grâce au kit d'acide nucléique total Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid et à l'appareil d'extraction automatisé Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Reportez-vous au mode d emploi du fabricant pour l'extraction de l'acide nucléique au moyen de ce kit. 2. Dans le menu déroulant «Protocole» du système MagNA Pure LC System, sélectionner dans la liste «Total NA», puis «Total NA Variable_elution_volume.blk». Cela chargera les réglages appropriés pour le test. 3. Le protocole de l'échantillon doit être : «Total NA Variable_elution_volume». 4. Le volume de l'échantillon doit être réglé à 200 µl et le volume d'élution doit être réglé à 50 µl. 5. Le volume de dilution doit être réglé à zéro pour tous les échantillons. 6. Assurez-vous que le protocole post élution est réglé sur «None» (aucun). 7. Assurez-vous que les standards de dosage sont dans le bon emplacement de la cartouche d'échantillons. 8. Passer chaque standard de dosage au Vortex pendant 2 à 4 secondes et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond des tubes. 9. Pipetez 200 µl de chaque standard de dosage et du contrôle sans matrice dans l'emplacement correspondant de la cartouche d'échantillons. 10. Vérifiez visuellement le niveau des standards de dosage et du contrôle sans matrice dans la cartouche d'échantillons afin de s'assurer que les standards ont été ajoutés. 11. Passez 2 fois au Vortex à pulsations l'adn de contrôle d'extraction et d'amplification (contrôle interne : IC) et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube.
3 Simplexa EBV Quantitation Standards Page Pour chaque ensemble de standards de dosage, dispensez à l aide d une pipette 100 µl de l'ic dans un tube conique contenant 6 ml de tampon de lyse. Mélangez brièvement au vortex. Ajoutez le plateau adéquat à l'appareil d'extraction MagNA Pure. 13. Transférez la cartouche d'échantillons dans l'extracteur automatisé d'acides nucléiques MagNA Pure LC et commencez la procédure d'extraction. 14. Lorsque l'extraction de l'acide nucléique est terminée, la cartouche contenant les standards de dosage extraites peut être retirée de l'appareil MagNA Pure et scellée. Conservez l'adn à une température de 2 à 8 C avant utilisation. Une conservation prolongée des standards de dosage extraits à cette température n'est pas recommandée. Gardez les échantillons d'adn extrait sur un bloc réfrigérant pendant le chargement du disque. Extraction par la méthode d'extraction biomérieux NucliSENS easymag 1. Se reporter au Manuel de l'utilisateur NucliSENS easymag pour le fonctionnement de l'appareil et du logiciel. 2. Choisissez la matrice générique dans le logiciel NucliSENS easymag avec le paramétrage suivant; Default Request (Demande par Generic (ou équivalent) défaut) : Run Name Prefix (Préfixe du (selon les besoins) nom de la série) : Sample ID prefix (Préfixe ID (selon les besoins) d'échantillon) : Sample Type (Type d Primary (primaire) échantillon) : Workflow Defaults (Paramètres Incubation de lyse dans l'instrument par défaut du flux de travail) : Incubation de silice dans l'instrument Reagent Tracking (Traçabilité réactif) : Traçabilité échantillons désactivée Lyse, Silice, Traçabilité du réactif de contrôle interne désactivée 3. Saisissez les renseignements pour chaque échantillon dans l'écran de Demande d extraction comme ci-dessous. ID échantillon : (Saisir le nom de l'échantillon) Request (Demande) : Generic (ou équivalent) Volume (ml) : 0,100 Eluate (Éluat) (µl) : 25 Type : Primary (primaire) Priorité : Normal Matrice : Autre 4. Créez la série d'extraction dans le logiciel NucliSENS easymag conformément au manuel de l'utilisateur. 5. Passer chaque standard de dosage au Vortex pendant 2 à 4 secondes et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond des tubes. 6. Pipetez 100µL de standard de dosage et de contrôle sans matrice dans le puits d'échantillon. 7. Passez 2 fois au Vortex à pulsations le contrôle interne et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 8. Pipettez 5 µl d'ic vers chaque standard de dosage et tous les puits de contrôles Changez d'embout entre les standards. 9. Chargez le(s) puits d'échantillons, les nouveaux matériels jetables d'aspiration et réactifs dans l'appareil easymag conformément aux instructions du manuel de l'utilisateur. 10. Démarrez la lyse intégrée et incubez les échantillons lysés pendant 10 minutes avant d'ajouter le mélange de silice magnétique. 11. Au cours de la période d'incubation de la lyse, préparez le mélange de silice magnétique. Mélangez la silice et diluez dans de l'eau sans nucléase en ajoutant 1 partie de silice magnétique à 1 partie d'eau sans nucléase (par exemple, 540 µl de silice magnétique µl d'eau sans nucléase). Préparez à peine 135 µl de mélange de silice magnétique par échantillon. 12. Pour transférer le mélange de silice dans les plaques de puits ELISA, mélangez la silice magnétique et utilisez 1 embout ainsi que le mode de fonctionnement P2 de la pipette Biohit. Appuyez sur Start pour aspirer µl du mélange de silice magnétique et appuyez de nouveau sur Start pour renvoyer le premier tirage dans le tube de mélange de la silice. Appuyez sur Start pour distribuer 125 µl du mélange de silice magnétique dans les 8 puits individuels de la plaque ELISA. Répétez selon le besoin pour des plaques ELISA supplémentaires. 13. Après les 10 minutes d'incubation de la lyse, utilisez 8 embouts (par plaque ELISA) et le mode de fonctionnement P3 de la pipette Biohit pour transférer 100 µl du mélange de silice magnétique vers chaque standard de dosage et contrôle sans matrice dans le puits d'échantillon. Placez les embouts dans les puits des plaques ELISA et appuyez sur Start pour mélanger et aspirer le mélange de silice magnétique. 14. Transférez le mélange de silice magnétique dans le puits d'échantillon approprié et placez les embouts de pipette dans les échantillons, en dessous du niveau liquide. Appuyez sur Start pour aspirer, distribuer et mélanger (x3) la silice magnétique et les échantillons. Assurez-vous que les embouts de pipette restent en dessous du niveau liquide afin d'assurer un mélange correct.
4 Simplexa EBV Quantitation Standards Page Répétez les étapes 13 et 14 pour des puits d'échantillons supplémentaires. 16. Après avoir ajouté le mélange de silice magnétique dans tous les échantillons, commencez la série d'extraction. 17. Lorsque la série est terminée, retirez le(s) puits d'échantillon(s) de l'appareil. Si les standards de dosages et les contrôles sans matrice ne sont pas destinés à une utilisation immédiate, transférez-les dans des tubes individuels pour limiter au minimum le risque de voir retomber la silice magnétique dans l'échantillon. Conservez l'adn à une température de 2 à 8 C avant utilisation. Une conservation prolongée des échantillons extraits à cette température n'est pas recommandée. Gardez les échantillons d'adn extrait sur un bloc réfrigérant pendant le chargement du disque. B. CONFIGURATION DE L'APPAREIL DE PCR TEMPS-RÉEL 1. Reportez-vous au Manuel de l'utilisateur de l'integrated Cycler pour plus de détails sur la façon de configurer le logiciel Integrated Cycler Studio pour ajouter une définition de tests, établir une courbe de référence des standards (Série de calibration) et analyser les séries de tests sur l'integrated Cycler. Remarque : Seuls les standards de dosage et le contrôle sans matrice peuvent être chargés sur une série de tests de calibration. Les échantillons de patient et les contrôles positifs pourront être testés après qu'une série de calibration valide aura été effectuée. Exemple de disposition du disque A QS-1 QS-3 QS-5 B QS-1 QS-3 QS-5 C QS-1 QS-3 QS-5 D QS-1 QS-3 QS-5 E QS-2 QS-4 NTC F QS-2 QS-4 G QS-2 QS-4 H QS-2 QS C. ZONE DE PRÉPARATION DU RÉACTIF Zone dédiée à la préparation du mélange réactif du test Simplexa TM EBV. 1. Décongelez le mélange d'amorces et le mélange maître à température ambiante (entre environ 18 C et 25 C). Chaque flacon de composant du kit contient suffisamment de réactifs pour 50 réactions. Avant chaque utilisation, mélangez doucement les composants du kit mélange d'amorces et mélange maître par inversion (6 à 8 fois) et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 2. Préparez le volume requis du mélange réactif dans un tube de microcentrifugeuse en polypropylène de taille appropriée par pipetage du volume de chaque composant comme indiqué dans le tableau ci-dessous. Volumes de mélange réactif Réactif Mélange réactif Mélange réactif Volume / 1 réaction Volume / 24 réactions Mélange maître Simplexa [Simplexa Master Mix] 4,0 µl 96 µl Mélange d'amorces Simplexa EBV [EBV Primer Mix] 1,0 µl 24 µl Volume total 5,0 µl 120 µl 3. Mélangez doucement le mélange réactif par inversion ou par pipetage (8 à 10 fois). 4. Centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 5. Poursuivez le paramétrage de la PCR. 6. Utilisez le mélange réactif dans l'heure qui suit sa préparation. Conservez le mélange réactif à une températude de 2 à 8 C si le paramétrage de la PCR ne doit pas être réalisé immédiatement après la préparation du mélange réactif. D. ZONE D'AMPLIFICATION PAR PCR EN TEMPS RÉEL Travaillez dans une zone dédiée à la préparation du Disque universel à 96 puits pour le test Simplexa EBV. Reportez-vous au modèle de disposition du disque, à la section B, tout en effectuant la préparation suivante : 1. Ajoutez 5,0 µl du mélange réactif à chacun des puits. 2. Ajoutez 5,0 µl du standard de dosage extrait dans le puits «QS» approprié. 3. Ajoutez 5,0 µl du contrôle sans matrice extrait dans le puits «NTC». 4. Recouvrez le disque avec l'adhésif (laminage) de couverture pour disque universel. 5. Ouvrez le couvercle de l'integrated Cycler. 6. Placez le disque universel scellé sur la platine. 7. Fermez délicatement le couvercle. 8. Cliquez sur Run (Exécuter). 9. Cliquez sur Start (Débuter).
5 Simplexa EBV Quantitation Standards Page 5 E. ANALYSE DE LA COURBE DE RÉFÉRENCE DES STANDARDS (SÉRIE DE CALIBRATION) LIMITES 1. L Integrated Cycler Studio déterminera automatiquement si une série de calibration est valide. a. Si elle est valide, la série de calibration sera automatiquement enregistrée pour être utilisée. b. Si elle n'est pas valide, la série de calibration sera éliminée et nouvelle série de calibration doit être effectuée avant qu'il soit possible de tester des échantillons de patients. 1. À utiliser avec le kit Simplexa EBV. 2. Les techniciens doivent être formés et avoir l'habitude des procédures de tests et de l'interprétation des résultats avant d'effectuer le test. 3. L'Integrated Cycler Studio conserve la dernière série de tests valide d'étalonnage pour quantifier les échantillons inconnus de patients. Les standards de dosage et les échantillons de patients doivent être extraits en utilisant la même méthodologie d'extraction, faute de quoi vous recevrez des résultats erronés. RÉFÉRENCES 1. NCCLS H18-A2. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 2nd ed. (1999). 2. CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4th ed. And National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A). REPRÉSENTANT AUTORISÉ mdi Europa GmbH, Langenhagener Str , Langenhagen-Hannover, Allemagne RENSEIGNEMENTS POUR LES COMMANDES Téléphone : (800) ((États-Unis uniquement) Télécopie : (562) (International) PI.MOL2410 Rév. C Date de rédaction: 20 avril 2012 ASSISTANCE TECHNIQUE Téléphone : (800) ((États-Unis uniquement) Télécopie : (562) Consultez notre site internet à l'adresse (International) Cypress, Californie États-Unis
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