Laboratoire Expert BVD - DS2 - Travaux en cours et Perspectives

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1 Laboratoire Expert BVD - DS2 - Travaux en cours et Perspectives Journée nationale de la référence professionnelle 4 novembre 2016 Aurore TEILLET Aude ALLEMANDOU Avec le soutien financier de la 1

2 Sommaire I. Performances des tests sérologiques p80 a) sérums individuels b) mélange de sérums II. Evaluation des kits PCR sur la matrice Biopsie Auriculaire III. EILA IV. Perspectives 2

3 Performances des tests sérologiques p80 3

4 Performances des kits sérologiques sérums individuels Caractérisation de 553 sérums de l échantillothèque avec tous les kits / protocoles en sérologie p80 8 résultats par échantillons 3 catégories d échantillons : Répartition des 553 sérums caractérisés 42 Négatifs avec tous les kits 236 Positifs avec tous les kits 275 Echantillons Positifs avec un ou plusieurs protocole(s) et Négatifs avec un ou plusieurs protocole(s) Résultats SN : 18 Positifs et 24 Négatifs Quelle est la Sensibilité / Spécificité des différents kits? 4

5 Performances des kits sérologiques sérums individuels Objectif : Comparaison des kits afin d évaluer la sensibilité et la spécificité diagnostique Choix de la méthode statistique: Absence de technique de référence : pas d hypothèse de départ où l on donne les VP et VN Echantillonnage de petite taille Construction d un statut théorique des échantillons selon la convergence des tests Kits évalués : 5 kits dont 3 proposant 2 protocoles. Comparaison de 8 protocoles 5

6 Performances des kits sérologiques sérums individuels Résultats : Sensibilité et spécificité des tests vis-à-vis du statut anticorps p80 Kit A court A long B C court C long D E court E long Sensibilité 92,60% 98,10% 95,90% 98,60% 96% 97,80% 99,70% 99,60% Spécificité 99,70% 99,60% 98,20% 99,60% 99,60% 98,30% 98,70% 97,90% Les kits C et E en protocole court sont les kits combinant les meilleures sensibilité et spécificité Poursuite caractérisation avec ces 2 kits Choix du kit C pour accréditation ELISA en 2017 Forte concordance des kits en analyse individuelle 6

7 Etude de séroprévalence mélange de sérums Interrogations du gestionnaire Quelle est la valeur d une analyse sérologique de mélange en BVD? Peut-on envisager d effectuer le suivi sérologique d un troupeau allaitant en définissant comme pour les cheptels laitiers des classes de séroprévalence? Protocole Sélection de 3 kits p80 de 3 producteurs de réactifs proposant un protocole en mélange Mélanges à partir d animaux de l échantillothèque avec un statut Ac p80 Positif ( ) ou Négatif ( ) N = 90 7

8 Etude de séroprévalence mélange de sérums Test de mélanges composés de 5, 10, 15 et 20 animaux avec +/-20% d animaux séropositifs Résultats Mélanges 20% de séropositifs Résultats Mélanges < 20% de séropositifs KIT A KIT C KIT E 5 animaux N ou P P P 10 animaux N ou P P P 15 animaux N ou P P P 20 animaux N ou P P P KIT A KIT C KIT E 5 animaux animaux N ou P P P 15 animaux N ou P N ou P P 20 animaux N ou P N ou P N ou P Résultats différents selon le kit utilisé Kit A : résultats variables selon les mélanges testés Kits C et E : Résultat Positif si 20 % de séropositifs et variable si < 20 % 100% 80% 60% 40% 20% 0% % de mélanges Positifs (38 mélanges) 97% 76% 5% KIT A KIT C KIT E 8

9 Nombre d échantillons Etude de séroprévalence mélange de sérums Les résultats observés sont-ils liés à une variabilité de la réponse immunitaire individuelle? Analyse en loi dose effet de 38 sérums Seuil de coupure KIT A KIT C KIT E 2 0 pur 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 Détectabilité des kits variable Réponse immunitaire individuelle variable 9

10 Etude de séroprévalence mélange de sérums 3 situations terrains à l échelle du troupeau Résultats de caractérisation de sérums d animaux issus de 3 cheptels avec le kit C %DO 100 Elevage 1 Elevage 2 80 Elevage 3 60 Seuil Zone de positivité 0 Cheptel majoritairement négatif Situation intermédiaire Cheptel majoritairement positif 3 cheptels différents : si mélange aléatoire = risque de résultat non représentatif 10

11 Etude de séroprévalence mélange de sérums Conclusion : Variabilité entre les kits et des réponses immunitaires Alternatives possibles pour repérer une circulation virale : Approche par classes de séroprévalence (équivalent cheptels laitiers) Kits à adapter? Diluer les mélanges de sérums avant analyse? A explorer Approche binaire Mise en place du suivi sur un groupe d animaux «sentinelles» Choix d un groupe de 5 à 20 animaux dans la jeune génération Alerte = Mélange Positif Animaux naïfs vis-à-vis du BVD «Sentinelles» Freins / Difficultés : complexe car situations régionales et conduites d élevage variables 11

12 Evaluation kits PCR sur la matrice Biopsie Auriculaire 12

13 Evaluation kits PCR sur la matrice Biopsie Auriculaire Diagnostic virologique du BVD sur la matrice Biopsie auriculaire (BA) Cahier des charges PCR Rédaction selon les critères de performance / Normes U et U CC disponible pour les producteurs de réactifs sur demande au LE-BVD Même démarche pour l ELISA (en cours de finalisation) Bilan évaluation de kits PCR Biopsie auriculaire 2016 Nombre de kits PCR : 4 Nombre de méthodes d extraction : 10 dont 1 non satisfaisante non commercialisée Matrices : BA individuelle et mélange (10) MR disponibles à ce jour : NED BA + Panel de 9 BA pour dilution du NED 13

14 EILA 14

15 EILA 15 Année Matrice BA Sérum et lait Sang total Méthode Nombre de participants ELISA Ag PCR 22 en ELISA 43 en PCR ELISA Ac ELISA Ag PCR 75 en sérum 19 en lait en ELISA en PCR 100% satisfaisants 100% satisfaisants Campagne 2017 : lancement début Janvier

16 Perspectives de travail pour

17 Echantillothèque Complétion et renouvellement: 45% des objectifs atteints Evaluation des besoins et des demandes pour 2017 Caractérisation : 2016 : sérums (Kits ELISA Ac) 2017 : laits Kits ELISA Anticorps Kits de PCR Virus et Antigène Meilleure connaissance Evaluation des caractéristiques des kits 17

18 Projet détectabilité d un IPI laitier Etat des lieux: Kits PCR avec taille de mélange proposée variable Augmentation des tailles de cheptels Diverses méthodes d extraction Problématique: Lait de tank = X laits individuels 18

19 Projet détectabilité d un IPI laitier Questions posées: Quel niveau de dilution? A quelle taille de cheptel? Peut-on optimiser cette détection? Correspondance dilution/taille élevage Nombe d animaux Production IPI ( L) Production élevage ( L) Taux dilution 1/8 1/63 1/344 1/693 1/1393 1/6993 Dilutions testées 1/10 1/100 1/1000 1/

20 Provenance des animaux sélectionnés IPI: 4 animaux : génotypes 1b et 1e 4 Elevages: Négatif = Ag et Ac Négatif Positif Ac (+ vaccination) Positif Ac > 30% Positif Ac 10%< séroprévalence cheptel < 30% 20

21 Détectabilité des IPIs laitiers: protocole Schéma expérimental: Lait d IPI Pool de laits 2 méthodes d extraction + PCR -Niveau de détection limite -Correspondance taille de cheptel -Répétabilité des méthodes d extraction -Optimisation de la méthode 21

22 Autres axes de développement & recherche 1. Avec les outils existants: 1. Poursuite des mélanges de sérum Optimiser les méthodes Nouvelles études Réponse objectifs de gestion 2. Détectabilité des IPI Sérum vs Sang Total (PCR et ELISA Ag IPI) Augmentation des mélanges / différentes matrices Laits, sérums, BA Finalité : Mieux répondre aux objectifs des GDS Identifier des méthodes préférentielles / objectifs de gestion Harmoniser les méthodes Simplifier le diagnostic de la BVD 22

23 Autres axes de développement & recherche 2. Nouveaux outils différentiels (BVD / autres Pestivirus) 1. Test direct : RT-PCRq Cible différente des tests commerciaux Différenciation des virus BVD, BD, Hobi et Chamois Typage rapide 2. Test indirect : ELISA- Ac Différenciation des Ac contre BVD et autres Pestivirus Etude bibliographique : faisabilité d un ELISA Ac? Différenciation BVD et autres Pestivirus Finalité : épidémiologie après éradication de la BVD origine de la circulation virale 23

24 Merci de votre attention 24