Microscopie confocale

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1 Microscopie confocale principes et applications 27 mars 2014

2 Plan de la présentation - Qu est-ce que la microscopie confocale? différence entre la microscopie conventionnelle et confocale type de microscopie confocale avantages et inconvénients de chaque type de microscopie confocale - Caractérisques des objectifs corrections des aberrations collier de correction NA - Fluorochromes utilisés en microscopie confocale traditionnels anticorps couplés protéines fluorescentes sondes environnementales quantum dots - Acquisition de l image Quenching et photobleaching bleed-through AOTF colocalisation

3 Plan de la présentation - Applications spécialisées de la microscopie confocale FRAP, FLIP FRET Photobleaching DIC analyse 2D, 3D ou 4D - Préparation des échantillons Fixation des tissus - fixatifs coagulants - fixatifs cross-linkers - facteurs affectant la fixation Démasquage antigéniques - Dispositif et avantage du FV1000

4 Différences entre la microscopie conventionelle et confocale

5 Différences entre la microscopie conventionelle et confocale Lumière élargie versus source d illumination définie Image entière versus section optique Pinhole

6 En résumé, en microscopie confocale on veut obtenir - une source lumineuse précise - une source lumineuse focussée sur l échantillon - un pinhole au point de détection de l image Les images confocales possèdent les caractéristiques suivantes - absence d interférence de la part de la lumière indirecte : plus grand contraste - absence de superposition du signal hors focus : image moins brouillée et plus précise - images provenant d une seule section optique augmente la performance.

7 type de microscopie confocale

8 Type de microscopie confocale 1) LSCM 2) Spinning disk 3) multiphotons 4) TIRFM

9 Laser scanning confocal microscopy Avantages sections optiques très minces: très grande précision des stuctures intracellaires Désavantages petit pinhole : rejet de fluorescence élevé, nécessite forte fluorescence photobleaching élevé : forte émission laser : temps d acquision élevé moins utilisé pour microscopie en temps réel

10 Spinning Disk Avantages vitesse d acquision rapide: photobleaching et phototoxicité très faible très utile pour la microscopie en temps réel Désavantages pinhole plus grand: moins grande précision de l image phénomène de pinhole crosstalk

11 Excitation multiphotonique On utilise un laser pulsé dans des fréquences proches de l'infrarouge ( nm). Flurochromes sont excités entre 400 et 500 nm donc, nécessite deux photons pour émettre sa fluorescence Dans ce cas, seul le point de focalisation du faisceau laser est excitateur et émettra une fluorescence (densité de photon suffisante pour coupler l'énergie d'excitation). Il n'existe pas d'iris confocal (sténopé, pinhole) dans un microscope biphotonique.

12 Excitation multiphotonique Avantages L'utilisation d'une lumière d'excitation à une longueur d onde élevée (> 900 nm) assure une plus grande pénétration à l'intérieur de l'échantillon (jusqu'à 500 µm au lieu de 150 µm) offrant la possibilité de travailler sur des échantillons plus épais. L'excitation des fluorophores étant limitée au point de focalisation du faisceau laser, le risque de photoblanchiement est réduit. Cette technique est naturellement utilisée pour l'excitation simultanée de plusieurs fluorophores à spectres d'émission différents. Désavantages En pratique, le rendement d'émission de fluorescence est moins bon qu'un confocal simple photon et le rapport signal/bruit est plus faible. Ainsi, il ne montre que peu d'avantage pour l'observation de cellules en culture ou de coupes de tissu (50-70 µm d'épaisseur). $$$

13 Total internal reflection fluorescence microscopy Utilise la lumière évanescente (indirecte) Liaison hormonale à son récepteur Neurotransmetteur Adhésion cellulaire Dynamiques membranaire et cytosquellette Avantages détection de fluorescence de faible intensité habituellement éliminé par une acquision conventionnelle illumination indirecte sur le spécimen: survie accrue des cultures en culture Désavantages peu de pénétration à travers l échantillon : acquision limité à l interface cellule-verre

14 Avantages de la microscopie confocale L élimination ou la réduction du bruit de fond provenant du plan focal (dégradation de l image) Capacité à contrôler la profondeur du champ visuel

15 Avantages de la microscopie confocale Possibilité d obtenir une succession de sections optiques à partir d un échantillon épais Regénération à l aide d un logiciel de la structure tridimentionnelle de l échantillon

16 Désavantage de la microscopie confocale 1) Lasers - limité au niveau des longueurs d onde d'excitation disponibles versus lampe au mercure ou Xénon - dispendieux (UV) - toxicité de l irradiation à haute intensité sur les cellules (LSCM Vs multiphoton et Nipkow) 2) $$$$$ - système de confocal personnel comme alternative

17 Caractérisques des objectifs

18 Caractéristiques des objectifs

19 Aberrations optiques Courbure du champ sphérique chromatique Indice de réfractrion des longueurs d ondes

20 Correction pour aberrations optiques Type d objectif Aberration sphérique Aberration chromatique Courbure du champ Achromat 1 couleur 2 couleurs Non Plan Acromat Fluorite 2-3 couleurs 1 couleur 2 couleurs Oui 2-3 couleurs Non Plan fluorite 3-4 couleurs 2-4 couleurs Oui Plan Apochromat 3-4 couleurs 4-5 couleurs Oui

21 Caractéristiques des objectifs

22 Caractéristiques des objectifs Collier de correction

23 Ouverture numérique (NA) - Mesure de la capacité de l objectif à rassembler la lumière - Corrélation directe avec la résolution (NA) = n(sinµ) n = indice de réfraction Indice de réfraction air :n = 1 Eau : n = 1.33 huile minérale : n =

24 Fluorochromes utilisés en microscopie confocale

25 Fluorophore pour la microscopie confocale

26 Traditionnel Peu couteux Fluorochromes reconnus Très photosensibles Alexa fluor Émission fluorescente intense Photosatbilité acccrue Spectre d absorption optimal à plusieurs lasers, Insensibilité à la variation de ph Très soluble dans l eau Disponible pour plusieurs longueur d onde d excitation et d émission permet des expériences avec marquages multiples Disponible sous différents formats (anticorps, protéines) Cyanine Profil d émission et d excitation similaire aux fluorochome traditionnels Photostabilité, solubilité dans l eau et fluorescence accrue Insensibilité au ph Disponible sous différents formats Possèdent généralement un spectre d absorption plus large que Alexa fluor

27 Protéines fluorescentes Avantages majeurs: permet d étudier une plus grande variété de signaux et d événements biologique Toxicité photodynamique faible ou absente Compatiblité élargie avec les tissus et organismes intacts Peuvent être fusionnées avec n importe laquelle des protéines d un être vivant par biologie moléculaire GFP et ses dérivés (Aequorea victoria) EGFP (S65T) BFP (FRET) CFP (FRET) YFP, EYFP DSReD (Discosoma striata) PA-GFP (photoactivable par UV) Kaede (photoactivable par UV)

28 Sondes fluorescentes environnementales Basées sur le changement de longueur d onde et /ou d intensité du spectre d excitation / émission produit par le fluorophore suite à sa liaison avec sa cible dans le but de mesurer la variation du flux intracellulaire. Calcium Fluo-3 et Fura-red, Indo-1 (laser UV) Magnésium Mag-fura-2 ph intracellulaire BCECF, SNARF-1 Sodium intracellulaire Corona Red

29 Sondes organelles Généralement composées d un noyau fluorescent rattaché à une structure interagissant avec l organelle via une liaison covalente, électrostatique ou hydrophobique Mitochondries Rhodamine 123 (perte de fluorescence suite à la fixation) Mitotracker (compatible avec la fixation à la formaldéhyde) Mito fluor (permet de quantifier la respiration cellulaire, incompatible avec la fixation) JC-1(quantifie le potentiel membranaire, ratio rouge / vert) Lysosomes Lysotracker (plusieurs longueur d onde d excitation et d émission disponible) (compatible avec la fixation) Lysofluor (utilisé pour l étude des aspects dynamiques des lysosomes dans les cellules vivantes) (changement de fluorescence suite à une protonation, indicateur de ph) Golgi BODIPY (se lie aux sphingolipides) (permet de quantifier l accumulation de lipide suite à un changement de fluorescence) Réticulum endoplasmique DiOC(6) (peut s accumuler dans d autres organelles) Dapoxyl (compatible avec la fixation mais non avec la perméabilisation par les détergents) Brefeldin A Anticorps monoclonaux (pour tous les organelles)

30 Quantum dots Cristaux de semiconducteurs (CdSe) purifiés de la taille d une nanoparticule Photostabilité Haute intensité de fluorescence Possède une excitation et émission d une seule longueur d onde en multiples couleurs

31 Acquisition de l image

32 Quenching et photobleaching Quenching: réversible et indépendant de la radiation Photobleaching : non réversible et provoqué par la radiation Quenching: produit par une variété de processus compétitifs induisant une relaxation d un électron (sans productionde photon) de l état excité à l état relaxe Photobleaching: survient lorsqu un fluorophore perd de façon permanente sa capacité à fluorescer due à un domage chimique induit par les photons Peut être limité en diminuant le temps d exposition du fluorophore à la source d illumination ou en diminuant l intensité de la source lumineuse Utilisé pour effectuer des techniques spécialisées comme le FRAP 0,2,4,6,8 et 10 minutes d exposition continue

33 Bleed-through Phénomène observé lorsque l émission d un fluorophore est détecté par le détecteur utilisé pour un autre fluorophore Ces artéfacts compliquent l'interprétation de résultats obtenus lors d'une étude de colocalisation

34 Bleed-through Importance choisir la bonne combinaison de fluorophores Utilisation de l'acquisition séquentielle

35 AOTF (Acousto-Optic Tunable Filter) - Permet d utiliser l acquisition séquentielle - le principal avantage de l AOTF est la haute vitesse de controle de l intensité lumineuse du laser et des longueur d ondes - Permet de définir une région d intérêt sur le spécimen

36 Colocalisation Au niveau biologique, c'est la présence de deux ou plusieurs molécules différentes résidants à la même location physique Souvent recours au sectionnement Z pour des échantillons épais (5µM) Fluorogramme

37 Artéfacts de colocalisation

38 Applications spécialisée de la microscopie confocale

39 Applications spécialisées en microscopie confocale FLIP/FRAP fluorescence loss in photobleaching (FLIP) et la méthode homologue recovery after photobleaching (FRAP) sont des techniques utilisées pour l observation du mouvement des composantes intracellulaires à l aide de la fluorescence.

40 FRAP/FLIP Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM)

41 Applications spécialisées en microscopie confocale FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

42 DIC (differential interference contrast) Polarisation de la lumière à l'aide d'un prisme de Normarski

43 Imagerie 3D Acquisition en temps réel (analyse 4D)

44 Quantification Colocalisation

45 Préparation des échantillons

46 Préparation des échantillons Fixation - le but de la fixation est de préserver à plus ou moins long terme un échantillon biologique (tissus ou cellules) en gardant aussi près que possible sa condition initiale - une bonne fixation permet la préservation de l antigénicité des épitopes - une fixation inadéquate procurera une fluorescence diffuse et temporaire - un fixatif idéal pénètre rapidement les cellules et tissus, préserve la structure cellulaire avant que la cellule ne réagisse et produise des artéfacts structuraux et ne cause pas d autofluorescence type de fixatifs (chimiques) - coagulant - éthanol - méthanol - acétone - cross-linking - glutaraldéhyde - formaldéhyde - EGS (ethylene glycol-bis-succinimidyl succinate)

47 Fixatifs coagulants: alcool, acétone Agissent en réduisant la solubilité des protéines et en brisant les interaction hydrophobiques qui procure le maintient de la structure tertiaire des protéine. Mécanisme très différents que celui procuré par les aldéhydes Les fixatifs coagulants les plus utilisés sont l éthanol et le méthanol - utilisés pour fixer des coupes congelés et des frottis cellulaires Ces trois fixatifs (acétone, MeOH, EtOH) sont rarement utilisés seuls pour fixer des tissus à moins d étudier les acides nucléiques Ils causent un rétrécissement considérable et une augmentation de la rigidité des tissus lors de la fixation.

48 Fixatifs coagulants avantages Fixe les spécimens en changeant rapidement l état d hydratation des composantes cellulaires Préserve souvent la reconnaissance antigénique Perméabilise la membrane cellulaire désavantages Cause un rétrécissement des spécimens Difficile de faire des images confocales précises lors d acquisions 3D Peut rétrécir la taille des cellules jusqu à 50% de leur taille Précipite les protéines (GFP)

49 Fixatifs cross-linkers: aldéhydes Agissent en créant des lients chimiques covalent entre les protéines du tissus permettant d ancrer les protéines soluble du cytosquelette et procure temporairement une rigidité additionnelle Formaldéhyde - de loin, le plus populaire fixatif utilisé - dissout dans l eau la formaldéhyde se nomme formaline - paraformaldéhyde est une forme polymérisée de la formaldéhyde - fixe les tissus en fixant les protéines (lysine) - effet reversible par excès d eau - bonne pénétration des tissus et effet prolongé - préserve la stucture secondaire des protéines et une majorité des structures tertiaires Glutaraldéhyde - cause une déformation des structures hélice-alpha des protéines - moins pénétrant que la formaldéhyde, nécessite de petits morceaux de tissus - surtout utilisé pour la microscopie électronique et peu idéal pour l immunohistochimie

50 Facteurs effectants la fixation ph - devrait être garder dans une zone physiologique (entre 4-9) - pour préserver des structures, il doit se situer entre 7.2 et 7.4 Osmolarité - hypotonique provoque une mauvaise fixation et un gonflement cellulaire - hypertonique résulte en un rétrécissement cellulaire Taille des spécimens - 1 à 4 mm d épaisseur Volume de fixatif utilisé - au moins de fois plus grand que le volume tissulaire Température - une augmentation de la température augmentera la vitesse de fixation (attention de ne pas cuire) Temps - comme règle générale, 1 heure par mm d épaisseur - le moins longtemps possible, le meilleur sera la fixation

51 Démasquage antigénique (antigen retrieval) La révélation de plusieurs antigènes peuvent être améliorée significativement par un pré-traitement des échantillons (coupes histologiques) avec des réactifs qui briseront les liaisons provoquées par la fixation à la formaline. Ce processus permettra de découvrir des sites antigéniques masqués Démasquage à la température ambiante (RTER: room temperature epitope retrieval) acide chloridrique acide formique Démasquage à la chaleur (HIER: heat induced epitope retrieval) tampon citrate (ph 6) tampon citrate-deta (ph 6.2) EDTA (ph 8) Tris-EDTA (ph 9) tampon saline (ph 9) tampon Tris (ph 10) Démasquage protéolytique (PIER: proteolytic induced epitope retrieval) protéinase K trypsine pepsine pronase protéase

52 Démasquage antigéniqueà la chaleur

53 FAQ Qu est-ce que le démasquage antigénique? Quelle méthode de démasquage antigénique devrais-je utiliser pour un anticorps spécifique? quelques compagnies testent leur anticorps pour les applications d immunohistochimie et vont inclure une méthode suggérée dans leur fiche technique (parfois sous-optimale). Comment planifier un test de démasquage antigénique pour un nouvel anticorps? au départ, vous pourriez essayer deux méthodes implicant la chaleur (HIER) comme le tampon citrate et le Tris- EDTA et une ou deux méthodes protéolytiques (PIER) comme la protéinase K et la trypsine. Cela devrait vous donner une chance d obtenir une méthode optimale pour votre anticorps. J ai essayé mes anticorps avec différentes méthodes de démasquage antigénique, aucune de fonctionne l anticorps pourrait ne pas être approprié pour des tissus fixés à la formaline et inclus dans la parrafine (quelques anticorps fonctionnent seulement avec des coupes congelées) ou l anticorps a des problèmes (expiration ou peu performant) ce qui pourrait vous amener à changer d anticorps Parmi les méthodes de démasquage antigénique à la chaleur, laquelle est la meilleure? La méthode tampon citrate (ph 6) est la plus utilisé. Quelques études ont démontré que le Tris-EDTA (ph 9) ou le Tris-HCl (ph 10) lui est supérieure. Un essai est toujours conseillé pour déterminer la meilleure méthode Quels sont les facteurs clés à considérer lorsque l on utilise un prétraitement à la chaleur (HIER) (1) La température de la solution de démasquage devrait être aux environ de 95 C. (2) Le temps d incubation doit être au minimum de 10 minutes et est habituellement de 20 minutes.

54 FAQ Dans la méthode de démasquage protéolytique (PIER), laquelle est la meilleure? La protéinase K semble être la plus utilisée. La concentration, le temps d incubation et la température sont probablement des facteurs plus importants à considérer. Un essai est toujours le meilleur moyen de déterminer quelle est la meilleure méthode Quels sont les facteur clés à considérer lorsque j effectue un prétraitement protéolytique (PIER)? (1) La concentration de l enzyme est habituellement de 0.05 à 0.1 % selon le type de tissus ou la fixation (2) Le temps d incubation varie de 5 à 30 minutes mais en général on incube de minutes (3) La température d incubation est à 37 C Dois-je effectuer un démasquage antigénique pour des coupes congelées? Le masquage antigénique n est pas nécessaire pour un immunomarquage sur des coupes congelée fraiches. Étant donné que cette étape permet de briser les liens formés par la fixation à la formaline et que les coupes congelées sont sectionnées et fixées avec de l acétone froid de 5 à 10 minutes. De plus, ces coupes sont fragiles donc un démasquage à la chaleur les détruieraient.

55 Dispositif et avantages du FV1000 SIM Scanner Système Spectral De Balayage Haute précision Configurations: Lasers Applications spécialisées

56 SIM Scanner Deux lasers indépendants permettent l observation et la stimulation simultané des échantillons Le premier laser est utilisé pour l imagerie confocale haute résolution tandis que le second laser est utilisé pour la stimulation des échantillons Avec l observation confocale simultanée, lors de la stimulation au laser, les réactions cellulaires rapides peuvent être précisément capturées Le SIM scanner est idéal pour une variété d applications incluant le FRAP, FLIP, photoactivation, FRET et plusieurs autres

57 Système Spectral De Balayage deux systèmes de canaux spectraux indépendants, chacun configuré avec un réseau de diffraction variable de détection à fente pour la séparation à haute résolution de longueur d'onde et le choix à grande vitesse de largeur de bande.

58 Haute précision Le système spectral fournit la résolution de longueur d'onde de 2nm Moteur de pas interne entièrement automatisé avec la Z-résolution de 0.01 micron Configurations Un Incubateur CO2 est présent autour de la plateforme motorisée ce qui permet de faire l acquisition d images sur une plus longue période de temp

59 Lasers Visible Multi-line Argon (457nm, 488nm, 514nm) laser Green Helium Neon (543nm) Diode laser 643nm UV Diode laser 405nm Diode laser 405nm (SIM)

60 Applications spécialisées FRET FLIP / FRAP Photoactivation 2D, 3D, 4D Colocalisation Quantification

61 Questions?