EXPRESSION DE L INFORMATION GENETIQUE

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1 PARTIE 2. EXPRESSION DE L INFORMATION GENETIQUE Introduction : On a montré que l ADN est le support de l information génétique, on a montré sa capacité à se répliquer, et ses propriétés de stabilité, ses propriétés à maintenir une information constante de génération en génération. Il est le support de l info génétique : la synthèse d une protéine se fait à partir de l information contenue dans un gène. Comment se déroule la synthèse des protéines? Quels sont les mécanismes moléculaires de la transcription et de la traduction? Ces deux étapes mettent en place la succession des aa dans la protéine (structure I) or on a montré l importance des structures II, III voire IV, comment les protéines deviennent-elles fonctionnelles après la traduction? Comment la quantité de protéines synthétisées est-elle ajustée aux besoins de la cellule : quels sont les processus de contrôle de l expression de l information génétique? On utilisera des exemples pris chez les Procaryotes et les Eucaryotes I. LA TRANSCRIPTION : SYNTHESE ET MATURATION DES ARN A. Quelques données expérimentales sur le rôle de l ARN 1) Les ARN sont synthétisés à partir d une matrice d ADN Le phage T2 est un virus à ADN, il y a synthèse d ARN. Question est-il complémentaire de l ADN? Expérience de Spiegelman Marquage des molécules : ARNm du T2 marqué au 32 P, ADN dut2 au 3 H. - Dénaturation : un mélange ADN/ARN est chauffé, à 100 environ, ce qui provoque la séparation des deux brins d ADN. Puis le mélange est refroidi lentement. - ultracentrifugation sur gradient de densité (chlorure de Césium) afin de séparer les molécules. Résultats : 3 bandes de radioactivité. (Stryer p95) Interprétation : La bande intermédiaire correspond à un hybride ADN/ARN. La séquence de l ARNm est complémentaire de celle d un des brins d ADN. L ARN est donc transcrit à partir d une matrice ADN. Remarque : l ARNm viral ne s hybride pas avec d autre catégories d ADN (bactérien ou autres virus), ce qui montre la spécificité de la complémentarité entre un ADN et son ARNm. 3 A T G G C T A G 5 ADN brin transcrit 5 U A C C G A U C 3 ARNm 5 T A C C G A T C Les ARN sont synthétisés par des ARN polymérases : - à partir d une matrice ADN - avec des précurseurs ribonucléotides trip ATP, GTP, UTP, CTP - des ions métalliques divalents (Mg 2+ ) Transcription : synthèse d une copie ARN à partir de l ADN (étape commune pour les ARNm, ARNt, ARNr) Traduction : synthèse d un polypeptide à partir de la matrice de l ARNm, nécessite aussi les ARNr et ARNr. Chez les Procaryotes, la transcription et la traduction se fait selon une même unité de temps et d espaces. D ailleurs, la traduction débute alors que la transcription n est pas achevée. (MET E. coli) Chez les Eucaryotes il y a une séparation des étapes dans le temps et l espace : Les ARN sont synthétisés dans le noyau puis exportés dans le cytoplasme où a lieu la traduction. B. La synthèse des ARN chez les Procaryotes : étape de transcription 1) L ARN polymérase de E. coli Chez les Procaryotes, une seule enzyme catalyse la synthèse de tous les types d ARN (r, t, m). L ARN polymérase est un complexe à plusieurs sous unités (450kD). On compte 4 types de sous unités, mais on distingue 2 formes de l enzymes (tab stryer p704) : - l holoenzyme 2, la sous unité peut se dissocier du complexe on a alors : - l enzyme cœur 2 contient les sites catalytiques 3 ADN brin codant

2 sous unité nombre masse (kd) rôle 2 37 mal connu forme les liaisons phosphodiester se fixe sur l ADN matrice 1 50 reconnaît le site promoteur et initie la synthèse L holoenzyme est nécessaire pour initier la transcription, l enzyme cœur peut poursuivre une transcription déjà entamée. 2) L initiation de la transcription Alberts p307 L initiation nécessite des séquences promoteurs ; ce sont des séquences dites Cis situés en amont du gène sur la molécule d ADN. Ces séquences permettent la reconnaissance du complexe enzymatique. CIS : séquence d'adn qui n'est pas transcrite mais qui fonctionne exclusivement in situ sous la forme d'une séquence d'adn, en contôlant l expression de gènes situés sur le même chromosome (même molécule d ADN). Rmq : sur le brin codant de l ADN, le 1 er nucléotide du gène est numéroté +1. Les séquences en amont (du côté 5 ) sont numérotées en négatif. De nombreuses séquences promotrices ont été comparées pour de nombreux gènes : on a pu construire une séquence consensus, issue de cette comparaison. Deux zones sont apparues particulièrement importantes : - La séquence autour du nucléotide -10 (région -10) - La séquence autour du nucléotide -35 (région -35) 5 Région -35 Région TTGACAT TATAAT +1 promoteur Mais tous les promoteurs ne sont pas strictement identiques : - certains sont dits forts, la transcription y est forte (toutes les 2s environ) - certains sont dits faibles, la transcription y est moins élevée (toutes les 10 min environ) Si la séquence des régions promoteurs est modifiée alors le niveau de transcription est modifié (cf. document véto partie 1) C est au stade de l initiation que la sous unité joue tout son rôle : elle permet la reconnaissance des séquences promoteurs ainsi que la fixation sur ces séquences. L holoenzyme se fixe sur l ADN (double brin) et se déplace le long de la molécule jusqu à rencontrer un promoteur. Là elle se fixe (grâce à ) de façon lâche sur les régions -35 et -10 : c est le complexe promoteur fermé. Puis elle se fixe de façon plus étroite à l ADN, parallèlement, elle sépare les deux brins à proximité de la zone -10. L ARN pol ouvre environ 2 tours d hélice : en effet, un seul des deux brins sert de matrice, les liaisons entre bases sont rompues. C est maintenant le complexe promoteur ouvert. On peut noter que le superenroulement négatif favorise l ouverture de la double hélice (il équivaut à des tours d hélice en moins). La synthèse de l ARN peut commencer, il n y a pas d amorce contrairement à la synthèse d ADN : l ARN pol peut commencer sa synthèse de novo. 3) L élongation de la transcription L élongation se fait aussi toujours dans le sens 5 3 Stryer p709. Là aussi un nucléotide libre avec 3 phosphate est apporté, l enzyme catalyse la formation de la liaison phosphodiester avec l extrémité 5 OH du nucléotide précédent. La rupture de la liaison entre les phosphates libère l énergie nécessaire à la mise en place de la liaison phosphodiester du polymère. C est la sous unité qui catalyse la formation de cette liaison. La synthèse se fait grâce au brin transcrit qui sert de matrice : l ARN pol ajoute les nucléotides complémentaires (complémentarité des bases encore), et réalise donc une copie à la séquence identique (aux erreurs près). Le brin matrice est donc lu dans le sens 3 5. La lecture et la synthèse se déroulent dans une bulle de transcription : une zone où les deux brins d ADN sont séparés. L ARN forme un hybride avec l ADN sur une longueur constante (environ 12pb).

3 L ARN se détache progressivement avec la progression de l élongation. La bulle se déplace tout comme l enzyme au fur et à mesure de l élongation. La double hélice s ouvre en avant et se réenroule à l arrière. Après environ 10 nucléotides ajoutés, la sous unité se détache, seule l enzyme cœur poursuit l élongation. La fixation est alors plus importante sur l ADN. La vitesse de fonctionnement est de 50 nucléotides/seconde. L ARN pol n a pas d activité exonucléase : elle ne peut donc pas corriger d éventuelles erreurs (comme le fait l ADN pol III). La fidélité de la transcription est un peu moindre que celle de la réplication par gène environ mais cette copie est transitoire et il y a toujours de nombreuses copies des ARNm ou ARNr ou ARNt. La transcription produit la plupart du temps des ARNm polycistroniques, qui comportent la copie de plusieurs gènes : 4) La terminaison de la transcription Il existe aussi des signaux de terminaison qui entraîne l arrêt de la polymérisation, la dissociation de l hybride ARN-ADN ainsi que la libération de l enzyme et la fermeture de la bulle. - Les séquences de terminaison comportent environ 40pb, riches en bases G et C puis une séquence riche en A (brin matrice). La séquence riche en GC est telle que l ARN peut s autoapparier. L ARN forme un épingle à cheveux, double brin. Comme elle contient beaucoup de G et C (3 liaisons) l épingle est stable. Puis il y a la zone avec des A associés avec des U, l interaction ARN ADN est plus faible, ce qui facilite le détachement de l ARN. Ainsi : l ARN polymérase ralentit lorsque se forme l épingle à cheveux, puis la zone avec A-U tend à séparer l ADN de l ARN. Puis l enzyme aussi se détache, le complexe ADN enzyme est rompu. - Il existe aussi un facteur protéique qui favorise la terminaison : le facteur (rho). Il s agit d un hexamère : 6 sous unités identiques. Il est capable d hydrolyser l ATP. Il peut se fixer sur l ARN simple brin (au niveau de séquences spécifiques) puis il se déplace le long de l ARN grâce à l hydrolyse de l ATP. Ainsi il finit par rencontrer l enzyme ARN pol et par provoquer la séparation entre l enzyme et l ARN. Apparemment, les deux systèmes existent séparément : certains gènes sont associés au système épingle à cheveu d autre au système rho. La sous unité se réassocie avec l enzyme cœur, l holoenzyme part à la recherche d un nouveau promoteur. Chez les Procaryotes, l ARNm subit peu ou pas de modifications, d ailleurs la traduction commence alors même que la transcription n est pas achevée. Les ARNm sont le plus souvent polycistroniques : ils comportent la séquence de plusieurs gènes adjacents. Par contre les ARN m d Eucaryotes subissent une maturation. C. Synthèse des ARN et maturation de l ARN messager chez les Eucaryotes Chez les Eucaryotes, il existe 3 types d ARN polymérases : - L ARN pol I est située dans le nucléole, permet la synthèse des ARNr 18S, 5.8S et 28S - L ARN pol II est située dans le nucléoplasme, permet la synthèse des ARNm. Notons que les ARNm sont monocistroniques : correspondent à un gène. - L ARN pol III est située dans le nucléoplasme, permet la synthèse des ARNt et de l ARNr 5S. On ne détaillera pas la structure des ARN pol eucaryotes. Les caractéristiques de l élongation sont assez similaires à celles des Procaryotes : pas d amorce, élongation 5 3, pas d activité exonucléase. L initiation est assez différente, chez les Eucaryotes, l initiation et la régulation de la transcription sont très liées. On reviendra sur le complexe d initiation lors de la régulation. Voyons ici un peu, l organisation des promoteurs eucaryotes

4 5 3 TATAAA Brin codant Boîte TATA entre -100 et GC CAAT Position en amont du gène mais sur le brin transcrit ou sur le brin codant Ces séquences promoteurs (séquences en Cis) ne sont pas reconnues par l ARN pol elle-même, mais par des protéines TF (Transcription Factors), ce sont les facteurs de transcription généraux (indispensables à toute transcription), qu on peut qualifier de facteurs Trans. Pour l ARN pol II il y a par exemple TFII A, B, C, D, E, et F. TF II D se fixe le premier en reconnaissant les séquences puis les autres arrivent, en coopération avec TBP (TATA Binding Protein). La fixation de tous ces facteurs de transcription permet la fixation de l ARN pol II. C est le complexe d initiation de la transcription. En qq sorte, le minimum vital, mais si il est seul le niveau de transcription reste assez faible : de nombreuses autres molécules interviennent mais on rentre dans le contrôle On ne parlera pas de terminaison, on va par contre préciser les mécanismes de maturation des ARNm. En effet, l ARNm (ou plutôt le transcrit primaire) subit des modifications dans le noyau avant d être exporté vers le cytoplasme. - une méthyl guanosine tri phosphate est ajoutée à l extrémité 5, ce qui forme la coiffe (guanyl transférase). L ajout de la coiffe se fait au cours de la transcription. Apparemment, la coiffe semble protéger l ARNm contre la dégradation des nucléases. - Une queue poly A est ajoutée à l extrémité 3. En fait une endonucléase coupe un fragment proche de l extrémité 3. Puis une poly A polymérase ajoute entre 150 et 200 résidus A. On obtient alors l ARN primaire ou ARN prémessager. Ensuite, vient un étape très importante : celle de l épissage. D abord, il faut comprendre la structure morcelée des gènes eucaryotes. La micrographie (TD p80) montre une expérience d hybridation entre un ARNm mature et la séquence correspondante de l ADN. L ARNm mature est plus court, et certaines portions de l ADN ne s hybrident pas avec l ARNm. Elles ont été retirées lors du processus de maturation. On distingue ainsi : les exons, les régions effectivement codantes qui sont maintenues dans l ARNm et les introns qui ne sont pas des zones codantes. L épissage consiste à retirer les introns et à ne conserver que les exons. L épissage a lieu dans le noyau après la fin de la transcription. Le mécanisme de détail n est pas à connaître mais voyons le principe. Le complexe enzymatique responsable de l épissage comprend des protéines et une classe particulière de petits ARN nucléaires snarn. L ensemble s appelle spliceosome Alberts p Les petits ARN reconnaissent des séquences particulières à la jonction des introns et des exons, en fait ils sont complémentaires des ces séquences. Stryer p722 - Ensuite, le spliceosome réalise un clivage à la jonction intron exon (côté 5 ) - L extrémité libre de l intron forme une liaison avec un nucléotide A particulier (site de branchement) : on obtient un intermédiaire en lasso - L autre extrémité de l intron est clivée. - Les deux extrémités libres des exons sont raboutées. Rmq : chez les unicellulaires, on a trouvé des systèmes d autoépissage : les ARN prémessagers catalysent leur propre épissage. Seul cas où la catalyse n est pas réalisé par des protéines. Bilan des modifications de la maturation d un ARNm : Exemple de l ovalbumine (Griffiths p309).

5 Une des conséquences du phénomène d épissage : l épissage alternatif. A partir d un gène morcelé d Eucaryote (ou gène mosaïque), on peut produire différents ARNm matures comportant différentes combinaisons d exons. Et par conséquent, autant de protéines différentes. Par exemple, le gène de la protéine tropomyosine du Rat. C est une protéine du cytosquelette des muscles ou d autres cellules. Mais les ARNm sont différents selon le type de muscle (lisse ou strié) et dans les fibroblastes ou le cerveau. Chacun correspond à une combinaison d exons particulière. Une modalité de régulation de l expression de l information génétique chez les Eucaryotes Alberts p 319 L ARNm mature est enfin exporté vers le cytoplasme via les pores nucléaires. Rappel de la structure d un pore nucléaire Alberts p315. D. Maturation des ARN de transfert et des ARN ribosomiaux 1) Modifications chimiques et structure III des ARNt Ces modifications concernent les ARNt procaryotes et eucaryotes, dont les organisations sont proches. Les ARNt sont des ARN contenant entre 70 et 90 nucléotides. Il existe à peu près autant d ARNt que d acides aminés. Chez les Procaryotes comme les Eucaryotes, les gènes d ARNt forment des séquences alignées en tandem. Chez l Homme, on connaît une 50aine de sites chromosomiques des gènes d ARNt portant chacun 10 à 100 copies. La plupart du temps, un long précurseur ARN contenant plusieurs gènes est synthétisé (ARN polycistronique). Puis ce précurseur est clivé par une ribonucléase. ARNt1 ARNt2 ARNt3 ARNt4 ARNt5 Etc Rappel de la structure d un ARNt. Ils subissent des modifications chimiques : - Certaines bases sont méthylées ou au contraire déméthylées. Il y a aussi des bases très modifiées (atypiques) par exemple dont on ne détaillera pas la structure. - Les précurseurs d ARNt subissent des clivages : des fragments sont retirés par exemple au niveau de la boucle anticodon. - L extrémité 3 est toujours identique CCA OH, ces 3 nucléotides sont ajoutés après la transcription. C est l endroit où sera attaché l acide aminé. Il y a aussi l acquisition d une structure 3D. - Une bonne partie des bases sont appariées, formant 3 épingles à cheveux (structure en feuille de trèfle). Sauf au niveau de 3 boucles, dont la boucle anticodon ainsi que la partie CCA en 3. On peut parler de structure II. - Mais il y a aussi une structure III : les branches se replient, l ARNt acquiert une forme en L. Des interactions hydrophobes stabilisent cette structure. On remarque que l extrémité CCA 3 est à l opposé de la boucle anticodon. Enfin, il y a activation de l ARNt, c est-à-dire association entre l ARNt et son acide aminé. Ce processus implique la reconnaissance de l acide aminé correspondant à l anticodon de l ARNt. L activation est réalisée par l aminoacyl ARNt synthétase. Cette enzyme catalyse la formation de la liaison covalente entre l ARNt et son acide aminé. Il existe une vingtaine d enzymes, spécifiques de chaque couple ARNt aa. Alberts p ère étape : l acide aminé réagit avec un ATP au niveau de son groupement COOH. Stockage d énergie. 2 ème étape : Liaison entre le COOH de l aa et l extrémité 3 OH de l ARNt. La rupture de la liaison ATP aa fournit l énergie pour la liaison aa-arnt. Il s agit d une étape cruciale : c est la véritable association anticodon aa. C est d ailleurs une association très fidèle grâce aux propriétés de l enzyme, qui possède Alberts p341 : - un site de reconnaissance de l anticodon - un site de reconnaissance de l aa - le site catalytique où se réalise la liaison mais aussi - un site de vérification correction : la liaison est hydrolysée si l aa est trop encombrant ou pas assez elle vérifie la nature de l aa grâce principalement à des interactions faibles. 2) Assemblage protéines ARNr dans les ribosomes 80 à 90% des ARN synthétisés sont en fait des ARNr. Chez les Eucaryotes, les gènes d ARNr forment des familles répétées en tandem dans une région appelée l organisateur nucléolaire (ON). L ON des chromosomes X et Y de la Droso contient respectivement 250 et 150 copies en tandem des gènes d ARNr. Ainsi, grâce à ces nombreuses copies,

6 la cellule peut produire de grandes quantités d ARNr. Toujours chez les Eucaryotes, on compte 4 sortes d ARNr : - Les ARNr 18S, 5.8S et 28S synthétisés via un seul précurseur qui est ensuite clivé en 3 morceaux. Synthétisés grâce à l ARN pol II du nucléole. - L ARNr 5S est synthétisé séparément et par l ARN pol III. Il existe des modifications chimiques comme des méthylations sur le ribose en des positions bien précises. Puis il y a acquisition d une structure spatiale : formation de boucles double brin par appariement. Puis ces boucles sont elles mêmes repliées selon une organisation complexe. Transparent. Les ARN correspondent toutefois à 2/3 des ribosomes, le reste étant des protéines. Ainsi : - les ARNr 5,8S, 28S et 5S s associent à environ 50 protéines ce qui aboutit à la grosse sous unité (60S) - L ARNr 18S s associe à environ 30 protéines ce qui aboutit à la petite sous unité (40S) Les protéines ribosomiques sont synthétisées dans le cytoplasme, elles sont importées dans le noyau. Dans le noyau, l assemblage protéines ARN r se réalise. Enfin, la petite sous unité et la grosse sont exportées séparément via les pores nucléaires (schéma FB) Notons seulement la structure d un ribosome procaryote : 30S + 50S = 70S. Dans les 2 cas, un ribosome est une très grosse structure : poids moléculaire en Mégadalton. On voit que tous les types d ARN ont exportés vers le cytoplasme (pour les Eucaryotes) : comment vontils interagir? Quels sont leurs rôles précis dans le processus de traduction? II. LA TRADUCTION : ASSEMBLAGE DES ACIDES AMINES A. Le code génétique : principe du codage La traduction consiste à passer d une information sous forme d une séquence de nucléotides à une séquence en acides aminés. On dispose depuis le début des années 60 du dictionnaire nucléotides aa, c est-à-dire le code génétique. Ne pas confondre l information génétique et le code génétique. Le code génétique repose sur une équivalence entre un triplet de nucléotides (ou codon) et un aa. Le code génétique est le plus souvent donné avec les triplets de l ARNm. Comme il y a 4 bases, le nombre de triplets possible est de 4 3 =64. Or il n y a que 20 acides aminés : il y a de la marge. En fait, le code est redondant : un acide aminé peut être spécifié par plusieurs triplets. Le plus souvent, seules les 2 premières bases sont signifiantes, la 3 ème peut être indifférente. Par exemple la proline peut être spécifiée par CCA, CCC, CCU, CCG. Certains codons sont des codons stop : ils ne spécifient pas d acide aminé, par contre ils commandent l arrêt de la traduction. Par exemple UGA. Par contre, le code génétique est non ambigu : un triplet donné ne spécifie qu un seul acide aminé ou est un codon stop. Le code génétique est non chevauchant : un nucléotide appartient à un codon et à un seul. Le code génétique est non ponctué : chaque nucléotide d un ARNm appartient a un codon. Il résulte de l ensemble de ces propriétés qu un ARNm comporte 3 cadres de lecture potentiels Alberts p336. Mais un seul de ces cadres de lecture permet de fabriquer la protéine correcte. Il est donc important de commencer la traduction sur le bon nucléotide et de démarrer sur le bon cadre de lecture : quels sont les signaux le permettant? Enfin, on peut noter que le code génétique est universel : il est le même pour toutes les espèces. A part qq différences par exemple entre le système nucléaire te mitochondrial. B. Mécanismes de la traduction chez les Procaryotes 1) L initiation de la traduction Nous disposons de 2 sous unités séparées de ribosomes, 1 ARNm, une vingtaine d ARNt porteur de leur aa. Comment ces constituants indispensables s assemblent-ils pour débuter la traduction? Le signal du début de la traduction est très important : il détermine le cadre de lecture. Si il y a un décalage, toute la protéine synthétisée sera erronée. Chez les Procaryotes : Le codon initiateur est en général AUG (ce qui correspond à la méthionine). Mais la plupart du temps, un ARNt spécial, dit initiateur, est nécessaire : il possède l anticodon (UAC) de la méthionine mais porte une méthionine modifiée : une méthionine formylée. On va voir que des protéines facteurs d initiation sont aussi indispensables : IF1, IF2, IF3. La sous-unité 30S est associée aux différents IF (IF1, IF2 et IF3). 1- La première étape de l initiation est la fixation de l ARNm à la sous unité 30S. Le facteur IF3 stimule cette liaison.

7 2- Puis l ARNt- formyl Met vient se lier au codon correspondant (AUG). Cette étape est activée par IF2. La synthèse doit commencer côté 5 et avec le codon initiateur. Le vrai codon initiateur est reconnu de la façon suivante : il est associé avec une séquence particulière située qq nucléotides en amont (séquence riche en purine, dite séquence Shine Dalgarno). Cette séquence est en fait complémentaire d un portion de l ARNr de la petite sous unité : elle est ainsi reconnue. On a alors le complexe d initiation 30S. 3- Enfin, la grosse sous unité (50S) vient s assembler. Ce qui nécessite l hydrolyse d un GTP (lié à IF2). Puis IF2, IF3 et IF1 (rôle pas clair) sont libérées. C est le complexe d initiation 70S. L ARNt initiateur est alors au site P. Rmq : la formyl Met sera retirée à la fin de la traduction. Les ARNm procaryotes sont polycistroniques : ils portent la séquence copiée de plusieurs gènes. Il y a plusieurs sites de fixation de ribosomes. AUG Gène 1 AUG Gène 2 UTR5 Shine Dalgarno Shine Dalgarno UTR3 2) L élongation de la traduction Alberts p345 La traduction est réalisée par des polyribosomes : plusieurs ribosomes lisent un ARNm en même temps, il sont simplement démarré à des temps un peu différents. L ARNm est lu de l extrémité 5 à l extrémité 3. La protéine est synthétisée de l extrémité Nt à Ct. Après l initiation les aa sont ajoutés selon un cycle à 3 étapes. Notre point de départ est : un peptide avec déjà 3 aa. Le dernier est encore lié à son ARNt, il est présent au site P. La liaison peptidique entre aa2 et l aa3 est formée. 1- L ARNt portant l aa suivant arrive au niveau du site A. Il y a interaction codon anticodon : les triplets sont complémentaires. En fait, il s agit d un système par essai erreur : si il y a complémentarité, le complexe ARNt-aa reste fixé. La fixation de l ARNt est facilitée par une protéine facteur d élongation (EF-Tu). EF-Tu possède un site de fixation au GTP et se fixe aussi à l ARNt-aa. Lorsque l ARNt-aa se positionne au site A, le GTP est hydrolysé et le EF-Tu est libéré. Ce processus prend aa ms : si l ARNt est incorrect, la fixation est lâche, il ne reste pas. Alors un autre est essayé. Si l ARNt est correct, la liaison codon anticodon est suffisamment forte, l ARNt reste. Il s agit d un système de vérification des erreurs : la fidélité est élevée. On remarque que le processus est coûteux en énergie. 2- La 2 ème étape correspond à la rupture de la liaison covalente entre l ARNt et l aa au site P. Cette rupture est exergonique. L énergie libérée permet la formation de la liaison peptidique entre l aa3 (site P) et l aa4 (site A). On remarque que la liaison se fait entre le COOH de l aa3 et le NH2 de l aa4 (élongation de la protéine de Nt à Ct). La formation de la liaison peptidique est catalysée par l activité peptidyl transférase de la grosse sous unité. Parallèlement, un changement de conformation permet le décalage de la grosse sous unité. C est la translocation. L ARNt du site A se retrouve au site P. L ARNt du site P se retrouve au site E. La translocation est favorisée par un autre facteur de traduction EF-G, qui utilise aussi l hydrolyse du GTP. 3- Une nouvelle série de changements de conformation décale la petite sous unité de 3 nucléotides. Le ribosome est prêt à recevoir un nouvel ARNt au site A Un point important concernant la redondance du code génétique et la reconnaissance codon anticodon par l ARNt. Certaines espèces d ARNt peuvent apporter leur aa spécifique en face de plusieurs codons (synonymes). Ceci est possible grâce à un flottement (wobble) autorisé dans l appariement des bases en 3 ème position. Par exemple, un G en 3 ème position de l anticodon peut reconnaître U ou C. L anticodon ACG peut par exemple reconnaître UGU et UGC correspondant à la cystéine. Il y a donc un seul ARNt pour les 2 codons de la cystéine. Mais il y a aussi des cas où certains aa sont acheminés au ribosome par différents ARNt alternatifs. Par exemple, la sérine est codée par 6 codons. Elle possède 3 ARNt (isoaccepteurs) avec des anticodons différents, ils sont capables grâce au flottement de reconnaître les 6 codons. Ils sont probablement transcrits à partir de gènes d ARNt différents.

8 3) La terminaison de la traduction Alberts p350 La fin de la séquence codante de l ARNm correspond à un des trois codons stop (UAA, UAG, UGA) : ils ne sont reconnus par aucun ARNt. Par contre, ils sont reconnus par des facteurs de libération RF (release factor). - Le facteur de libération RF a une structure 3D qui mime un ARNt. Ainsi, il peut se fixer sur le site A face au codon stop. - Un GTP est hydrolysé ce qui provoque l addition d une molécule d eau à la protéine. Le dernier aa est libéré de son ARNt. La chaîne peptidique se spéare du ribosome. - Puis le ribosome se dissocie de l ARNm et les deux sous unités se séparent. A la fin de la traduction, la structure primaire de la protéine a été mise en place. Bilan : ADN en 1 copie ARNm N copies fidélité de l ARN polymérase Protéine N copies fidélité de l ARNt synthétase et de la traduction (EF-Tu) Il y a un phénomène d amplification Rappel de la localisation pour les Procaryotes et les Eucaryotes. III. LE CONTROLE DE L EXPRESSION DE L INFORMATION GENETIQUE A. L opéron est l unité d expression et de contrôle chez les Procaryotes 1) Répression induction par le lactose : un contrôle négatif Les bactéries sont des organismes capables de répondre très rapidement à un changement dans leur environnement. Par exemple, elles sont capables de réaliser différentes voies métaboliques selon les métabolites disponibles (arabinoses, lactose, glucose ). La cellule est en fait capable de synthétiser les enzymes de certaines voies métaboliques et de réprimer complètement la synthèse d autres enzymes inutiles. Par exemple : E. coli peut utiliser le lactose comme seule source de carbone. La voie métabolique utilise la galactosidase qui hydrolyse le lactose en glucose + galactose. Une perméase est aussi indispensable : elle permet l entrée du lactose dans la cellule. Stryer p800 On peut mesurer la quantité de galactosidase produite par la cellule en absence ou en présence de lactose. Résultat : en présence de lactose, la quantité d enzyme augmente dans la cellule. Interprétation : le lactose active la synthèse de l enzyme galactosidase. Il a été montré par ailleurs qu il s agit bien d une synthèse accrue d enzyme et pas d une activation d un précurseur préalablement présent. On dit que l enzyme est inductible. Le lactose est l inducteur. Dans les années 50, les chercheurs français François Jacob et Jacques Monod ont décrypté le contrôle du métabolisme du lactose, le mécanisme par lequel la synthèse de galactosidase est activée en présence de glucose. En fait, le système comprend 3 gènes dits de structure codant pour les enzymes : - Galactosidase : gène Z - Perméase : gène Y - Transacétylase : gène A, une troisième enzyme non indispensable, rôle encore peu clair. Les 3 gènes sont adjacents sur le chromosome bactérien. Ils sont transcrits en une seule molécule d ARNm polycistronique. La traduction permet de fabriquer les 3 protéines différentes. Jacob et Monod ont isolé des mutants du métabolisme du lactose, certains sont incapables de synthétiser une des 3 protéines, par exemple le génotype z-y+a+, est incapable de fabriquer la galactosidase. Ils ont isolé un mutant particulièrement intéressant, appelé mutant constitutif, noté I - : il fabrique en permanence (avec ou sans inducteur) de grandes quantités des 3 enzymes. Etude des mutants I - : poly. Bilan : la séquence i est une séquence de contrôle (ou gène de contrôle par opposition aux gènes de structure). Le taux de synthèse des trois protéines est contrôlé par un élément commun différent des 3 gènes de structure, appelé alors i. L hypothèse la plus simple est que la protéine issue du gène i est un répresseur de la synthèse des enzymes. L allèle i+ est transdominant : le gène i code effectivement pour une protéine diffusible, élément de contrôle TRANS Si ces hypothèses sont vraies, on peut imaginer qu il existe une séquence sur l ADN, reconnue par la protéine i répresseur. Ainsi, la protéine i pourrait se fixer sur l ADN et agir.

9 Jacob et Monod ont identifié une autre catégorie de mutants constitutifs : les mutants O c. Etude des mutants O c : poly Bilan : Le phénotype est aussi un phénotype constitutif, la séquence O est une séquence de contrôle. O a un effet répresseur sur la synthèse des protéines de structure. Mais O+ est seulement cis dominant : O ne code pas pour une protéine de contrôle diffusible, O correspond à une séquence ADN non transcrite, qui agit comme un «anti-promoteur». O pourrait être la séquence reconnue par la protéine i. Après de nombreuses autres expériences de génétique, Jacob et Monod ont proposé un modèle structural et fonctionnel de l opéron lactose. Le gène I codant pour le répresseur est proche des gènes de structure ZYA. Deux sites régulateurs sont présents entre I et les gènes ZYA. Le site P correspond au site promoteur, sur lequel se fixe normalement l ARN polymérase (boîte TATA ). Il y a aussi le site O (opérateur), comprenant une 20aine de bases : c est le site sur lequel se fixe la protéine i répresseur. En effet le répresseur reconnaît spécifiquement une courte de séquence du site O situé en amont (en cis) du gène Z, ainsi le répresseur i n agit que sur le groupe de gènes concernant le lactose. L ensemble i p o z y a forme donc un opéron: une unité génétique d expression coordonnée. Stryer p801 et 802 En absence de lactose (ou d autres inducteurs) le répresseur i se fixe sur le site o, il empêche alors l ARN polymérase de réaliser la transcription des gènes ZYA. Il s agit donc d un contrôle négatif. En présence d inducteur, par exemple de lactose, il se forme un complexe lactose répresseur. La protéine change de conformation et son affinité pour le site o baisse considérablement. L ARN polymérase peut alors se déplacer de son site promoteur vers les gènes de structure et les transcrire. Le répresseur lac i est un protéine en tétramère, 4 sous unités identiques. Elle possède un site reconnaissant la séquence o et caque peptide possède un site de fixation de l inducteur (lactose et certains de ses analogues). Il est intéressant de remarquer que la séquence o présente une symétrie tout comme le répresseur lui-même, ce qui permet l établissement de liaisons faibles entre la protéine et l ADN. 2) Activation par le complexe AMPc CAP : un contrôle positif Griffiths p342 Un système de contrôle vient en amont de l induction par le lactose. Si glucose et lactose sont présents en même temps, le glucose est utilisé préférentiellement par la cellule. En fait, la synthèse de la galactosidase n est pas induite tant que le glucose n a pas été complètement consommé. La présence de glucose influence la concentration d AMP cyclique (AMPc). L AMPc peut former un complexe avec une protéine CAP (Catabolite Activator Protein). Le complexe CAP-AMPc peut se fixer sur l ADN au niveau d un site spécifique situé juste en amont du site promoteur. Lorsque le complexe CAP-AMPc est fixé, l affinité de l ARN polymérase pour le site promoteur est élevée et la transcription a lieu. Il s agit bien d un contrôle positif. Commet se système intervient-il dans les métabolisme du glucose et du lactose? - Glucose présent, lactose absent. Si le glucose est présent, un produit de son catabolisme inhibe la formation de l AMPc. Le complexe CAP-AMPc ne se forme pas il n y a pas activation de la transcription. De plus en l absence de lactose, le répresseur inhibe cette transcription. - Glucose présent, lactose présent. Le lactose est présent, formation du complexe répresseur inducteur, potentiellement la transcription a lieu. Mais le niveau AMPc est faible. Pas d activation de la transcription. La transcription a lieu mais quantité d ARNm produit faible. - Glucose absent, lactose présent. Complexe inducteur répresseur permet la transcription. Complexe AMPc CAP active la transcription : beaucoup d ARNm produits. Bilan : la cellule peut activer ou réprimer la transcription de chaque gène ou groupe de gènes. La cellule module l activation ou la répression de la transcription en fonction des conditions environnementales. B. Condensation de la chromatine et complexe d initiation de la transcription participent au contrôle chez les Eucaryotes Les Eucaryotes peuvent être des pluricellulaires, chaque cellule d un organisme contient le même génome : bien sûr le même nombre de chromosomes propre à l espèce mais de plus la même information (la même séquence) sur son ou ses jeux de chromosomes (les mêmes allèles). Par exemple, on peut prélever des cellules de carotte différenciées, les mettre en culture, isoler une cellule et régénérer un individu entier à partir de cette cellule. La manipulation est plus compliquée chez les

10 animaux : mais on peut prélever un noyau de cellule différenciée, et le mettre à la place d un noyau d ovocyte et reconstituer ainsi un nouvel organisme. (cf. Expérience de Gurdon). Par contre, chaque type de cellule différenciée produit un ensemble spécifique de protéines, propre à sa fonction (cf. expérience de l ARN dans la partie 1). Electrophorèse 2D de 2 types cellulaires Alberts p378 L expression des gènes est contrôlée à «long terme». De plus, les quantités et types de protéines produites varient en fonction de l environnement : par exemple la synthèse des enzymes digestives peut être activée par certains signaux (hormonaux ou nerveux) en fonction d un apport de nutriments ou d un jeûne. Il s agit plus d un contrôle à court terme. Le contrôle de l expression peut se faire à différentes étapes de la synthèse des protéines : de l ADN à une protéine mature (schéma à faire) Le mécanisme majeur de contrôle se situe néanmoins au niveau de la transcription. Chez les Eucaryotes, l initiation de la transcription est très étroitement liée à la régulation. Le complexe d initiation de la transcription. D après Alberts Comme chez les Procaryotes, il existe des séquences en cis impliquées dans la transcription. Le promoteur central correspond à la zone du début du gène à la boîte TATA (vers -30pb). Les éléments proches du promoteur (éléments proximaux) sont des séquences distants de 100 à 200 pb du site du début de transcription. Des facteurs généraux de transcription (transcription factors, TF) se fixent au niveau de ces promoteurs, en particulier une protéine de fixation à la boîte TATA. Ils permettent à l ARN polymérase II de se fixer sur l ADN et à débuter la transcription. On les appelle facteurs généraux car ils sont nécessaires pour que l ARN pol débute la transcription, mais ils n assurent en général qu un faible niveau de transcription. On compte près d une dizaine de facteurs généraux de la transcription. L ensemble des facteurs généraux de transcription et de l ARN pol forme le complexe d initiation de la transcription. Il existe aussi des séquences éloignées : les enhancers (=amplificateurs) sont des séquences impliquées dans l activation de la transcription. Les silencers au contraire sont impliqués dans la répression de la transcription. Ils ont en commun d être situés à grande distance du site de la transcription : 50kb voire plus. De plus, ils peuvent être situés en amont ou en aval du gène, ou encore à l intérieur du gène. La plupart des modèles expliquant le rôle des enhancers impliquent des boucles de l ADN, rapprochant séquence enhancer et zone de transcription. Le fonctionnement implique des protéines activateurs qui se fixent à l ADN au niveau des enhancers. Ainsi que des co-activateurs (de nature protéique aussi) qui font le lien entre les activateurs et le complexe d initiation de la transcription. Les enhancers peuvent être spécifiques de certains tissus. Par exemple, la vitellogénine est une protéine fabriquée dans deux organes chez la Drosophile : dans les ovaires ou des les corps gras (qui jouent le rôle de foie chez la mouche). Dans les 2 cas, la vitellogénine est transférées aux réserves des ovocytes. L expression de ce gène est sous le contrôle de 2 enhancers, l un est actif dans l ovaire, l autre est actif dans le corps gras. Un enhancer intervient spécifiquement selon le tissu, son rôle est directement lié aux protéines activateurs et co-activateurs. Des signaux de niveaux supérieurs intracellulaires ou extracellulaires sont souvent nécessaire dans cette voie d activation de la transcription. Un exemple connu est celui des hormones stéroïdes, par exemple les hormones thyroïdiennes. Ce sont des hormones hydrophobes, capables de traverser la mb plasmique et de rentrer dans la cellule. A l intérieur de la cellule, elle se fixe à un récepteur intracellulaire protéique. Ce récepteur possède 2 domaines : l un de fixation à l hormone, l autre de fixation à l ADN. Le récepteur est fixé constitutivement à une séquence «enhancer» particulière : HRE élément de réponse à l hormone. HRE est situé en général en amont du gène cible (côté 5 du brin codant). Remarque : le récepteur a une structure dimérique. Toutefois, en l absence d hormone (=en l absence de ligand), un co-répresseur vient interagir avec le récepteur, et la transcription est inhibée. En présence de l hormone, le co-répresseur est libéré, un complexe co-activateur (protéines intermédiaires) se forme : la transcription de certains gènes spécifiques est ainsi activée. Un des modes d action est la stabilisation du complexe de préinitiation : TFIID et TBP, ce qui enclenche l initiation de la transcription. Griffiths p358 Enfin, la structure de la chromatine est un élément important du contrôle de la transcription. On a remarqué que les gènes exprimés dans un type cellulaire se trouvent toujours dans l euchromatine moins condensée (cf. support de l information génétique, niveau fibre 300nm de diamètre, boucle décondensée). Il existe donc des protéines qui contrôlent le niveau de condensation de la chromatine et les interactions avec les histones, permettant ainsi le passage de l ARN polymérase. Apparemment, l organisation en nucléosomes n empêche pas le passage de l ARN pol :

11 - le complexe avec les histones est défait avant son passage remis en place ensuite (facteurs protéiques de réorganisation des nucléosomes) Des protéines modifient aussi la structure de la chromatine en remodelant les nucléosomes. - Les histones acétylases catalysent l acétylation des histones ce qui tend à déstabiliser la structure de la chromatine et donc à faciliter la transcription. L acétylation modifie la répartition des charges (+) et diminue l interaction ionique avec l ADN. On peut reprendre l exemple des hormones thyroïdiennes, lorsque le complexe hormone récepteur est formé, il existe une activité d acétylation des histones, ce qui déstabilise les nucléosomes et décondense la chromatine, toujours par le biais du complexe co-activateur. A l inverse, la répression de l expression d un gène passe souvent par la compaction de la région concernée (en hétérochromatine), grâce au corépresseur, en absence d hormone. (Document Geray) Par contre, les régions de contrôle (promoteurs, amplificateurs ) semblent être impérativement décondensées : sans même la structure en nucléosomes. Elles sont accessibles à l interaction avec les différentes protéines activatrices de la transcription. De telles modifications locales de la chromatine permettent un accès facilité à l ADN pour les facteurs de transcription et l ARN pol. Avant même l initiation proprement dite donc. Bilan : - un promoteur eucaryote peut accueillir plus de 10 à 15 protéines dans le complexe d initiation de la transcription - Un amplificateur peut aussi être sous la dépendance d une douzaine de protéines - Le contrôle de la condensation de la chromatine requiert aussi de nombreuses protéines Bref, c est pas simple!!!! C. Le contrôle de l expression implique des protéines se liant à l ADN Le répresseur lac, les protéines activateurs (facteurs de transcription) des Eucaryotes sont des protéines capables de se lier à l ADN : elles établissent des liaisons faibles avec l ADN. On retrouve des caractéristiques générales parmi les protéines de contrôle de la transcription se liant à l ADN. On a vu que l ADN est une molécule chargée négativement (présence des groupements phosphate) interaction ioniques, les bases azotées forment un environnement globalement hydrophobe interaction hydrophobes. Néanmoins, certains atomes N ou O des bases peuvent être des accepteurs pour des liaisons H, et des atomes d H peuvent être des receveurs. Les bases sont plus facilement accessibles au niveau du grand sillon, et la formation de liaisons H est plus facile dans le grand sillon aussi. Les protéines facteurs de transcription ou se liant à l ADN montrent des motifs en nombre restreint. Les facteurs de transcription se lient en générale à des séquences particulières qu ils reconnaissent. Les facteurs de transcription se lient aux séquences de contrôle : aux promoteurs, aux amplificateurs motif exemple Structure et interactions avec l ADN Hélice boucle hélice (H-T-H) Alberts p385 Doigt de zinc Alberts p387 Leucine zipper Alberts p388 Hélice boucle hélice (HLH) Alberts p390 CAP, répresseur lac (griffith p359) Protéines à homéodomaine (stm et wus du MAC) Récepteur aux glucocorticoïdes (hormones stéroïdes) Facteur de transcription Gcn4 de la Levure, métabolisme des aa protéines de la famille MyoD L angle entre les 2 hélices est constant, par interactions faibles entre les hélices. L hélice «de reconnaissance» se fixe dans le grand sillon. La séquence en aa joue un rôle important dans la reconnaissance d une séquence ADN particulière. Interactions faibles entre hélice de reconnaissance et les bases azotées. Le plus souvent protéines en dimères, montrant le motif H-T-H en symétrie. Exemple : une hélice α et liée à un feuillet β par un atome de Zn. Cete unité peut être répétée et les hélices α interagissent avec le grand sillon. On trouve souvent des His et des Arg dans les hélices, acides aminés basiques, chargés + interagissant avec les charges de l ADN. 2 hélices α forment un dimère par interaction entre les aa hydrophobes, leucines majoritairement. Il se forme un motif hélicoïdal de niveau supérieur en forme de Y, les deux branches interagissent avec les grands sillons. Homodimère ou hétérodimères possibles. Une hélice α courte reliée à une hélice α longue par une boucle. 2 motifs s associent en dimère (homodimère ou hétérodimère). La grande hélice interagit avec le grand sillon, les petites hélices maintiennent le dimère (interaction hydrophobe par exemple) Données générales sur les protocoles : On utilise comme molécule inductrice un analogue de synthèse du lactose l IPTG.

12 On peut construire des diploïdes partiels : on produit des bactéries qui possèdent un génotype particulier sur leur chromosome (IZY), on leur ajoute un plasmide qui contient les gènes IZY, avec un génotype particulier. On mesure l activité des enzymes (galactosidase ou perméase) : un signe + indique que l enzyme est présente (synthétisée) et active, un signe indique que l enzyme n est pas fabriquée ou inactive. Les mutants constitutifs I - On a appelé I le locus, qui, si il est muté donne les mutants constitutifs (tab 1), souche 2. Induite = avec IPTG et non induite = sans IPTG Résultats : Les souches I - produisent en permanence la galactosidase et la perméase, même en absence d inducteur. On construit des diploïdes partiels (souche 3 et 4). Souches 3 et 4 : Le diploïde possède I + et I -, il a un phénotype inductible (phénotype [I + ]). Même si les gènes de structure sont fonctionnels sur l autre molécule (souche 3 : I + sur le chromosome, Z - sur le chromosome, Z + sur le plasmide). On dit que l allèle I + est dominant en trans sur I -. Interprétation : Le gène I code pour une molécule qui un répresseur diffusible. Il suffit que le répresseur soit présent dans le milieu pour qu il soit actif sur les deux séries de gènes contrôlés. En fait, le répresseur muté I -, ne reconnaît pas le site opérateur O, tout en formant le complexe avec l inducteur (Lactose). Règle générale : La trans dominance indique un produit diffusible.

13 Les mutants opérateur constitutif (O c ) Induite = avec IPTG et non induite = sans IPTG Résultats : Les souches notées O c (souche 3) sont aussi des mutants constitutifs : la synthèse de la galactosidase et de la perméase est élevée en présence ou non de l inducteur (lactose). Cette fois, l allèle O c a une dominance particulière : il ne provoque l expression constitutive que pour les gène Z ou Y positionnés sur la même molécule que lui. Exemple : souche 4, O + Z - Y + /FO c Z + Y -. Le plasmide comporte un allèle Z +, l expression est constitutive. Le plasmide comporte Y - et le chromosome Y +, mais l expression de Y n est pas constitutive (dans cette configuration, c est O + qui est dominant). On dit alors que c est de la Cis dominance. La cis dominance reflète l action d un élément qui n affecte que les gènes qui lui sont adjacents. Interprétation En fait, chez les mutants O c la séquence O (opérateur) de fixation du répresseur est mutée. Le répresseur ne peut pas le reconnaître et se fixer dessus. Par conséquent, l expression des gènes Z et Y est bien constitutive. On peut créer un diploïde partiel, O + /O c, les gènes situés en aval de O c seront toujours exprimés, même en absence de l inducteur. Par contre, les gènes contigus à l opérateur O + restent soumis à la répression. Règle générale : la cis dominance indique l action d une séquence promoteur (à effet positif ou négatif, comme O)

14 Les mutations I S. Les mutants I s ont une faible production de galactosidase et de perméase, même en présence de l inducteur (Lactose). Ils ne sont pas inductibles non plus. Dans les diploïdes partiels, les constructions I S /I + et I S / I- montrent tous les phénotype [I S ]. On voit là que la mutation I S est dominante en trans sur I + et I -. tableau Là aussi la mutation touche le répresseur diffusible. Le répresseur est actif en permanence. On suppose que le répresseur reconnaît le site opérateur O, mais qu il ne peut plus former le complexe avec l inducteur (lactose). Schéma