-Pas de symptômes, mais BK toujours présent -Pathogène non détectable -Examens radiologiques pouvant être normaux -Pas de réponse Anticorps
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- Henriette Beaudet
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1 Outils immunologiques innovants de détection de la tuberculose latente La tuberculose Expérience au CHU de Nancy avec le test T-Spot.TB Marcelo de Carvalho PU-PH, Laboratoire d'immunologie CHU de Nancy, Université de Lorraine Un tiers de la population mondiale est infectée (estim. 2 milliards d individus) par Mycobacterium tuberculosis 9 millions de nouveaux cas et 1,4 Millions de décès en 2010 Maladie pulmonaire dans 70% des cas mais atteinte possible d autres organes L infection primaire et le «priming»de la réponse immune anti-tuberculose 1 er contact avec le bacille Déposition alvéolaire de quelques bacilles, chancre d inoculation (foyer primaire) Multiplication dans les macrophages alvéolaires après phagocytose Drainage vers le ganglion hilaire satellite, dissémination (foyers 2 aires ) Mise en place d une réponse àmédiation cellulaire Accumulation de cellules monocytaires d allure épithélioïde avec couronne de lymphocytes et nécrose caséeuse Tuberculose active et latente Exposition àune personne présentant une TB active -Pas de symptômes, mais BK toujours présent -Pathogène non détectable -Examens radiologiques pouvant être normaux -Pas de réponse Anticorps Diagnostic difficile - Détection par l IDR àla tuberculine et tests IGRAS La personne devient infectée Contrôle initial de l infection par les cellules T, mais l infection est toujours présente et cliniquement sous jacente L infection demeure jusqu àla mort TB LATENTE Réactivation 5% 5% Si exposition insuffisante : tous les germes disparaissent Maladie symptomatique Pathologie en cours Les patients peuvent alors infecter d autres personnes Sans traitement, ~50% décèderont TB ACTIVE -Les symptômes suggèrent une TB - BK peut être détecté dans l expectoration ou autres échantillons par examen direct, culture ou biologie moléculaire -Les examens radiologiques montrent une pathologie pulmonaire - Diagnostic compliqué dans la TB non pulmonaire (enfants particulièrement vulnérables)
2 Immunité cellulaire Immunité cellulaire IL-2 IL-4 Lymphocytes T naïfs Génération de diversité du TCR dans le thymus Sélections positive et négative TCR spécifique d Ag Circulent dans le sang périphérique et organes lymphoïdes secondaires Interactions CPA- cellules T IFNg Sécrétion de cytokines TNFa Cytotoxicité Prolifération / Apoptose Faible fréquence (~1/ pour un Ag donné) Expriment CCR7 (récepteur chémokines) et CD45RA Passage par HEV vers la zone lymphocytaire T «Scannent» les cellules dendritiques pour reconnaissance de l Ag Réponses immunes cellulaires spécifiques d Ag Phases de l immunité adaptative Reconnaissance spécifique de l antigène Activation Différentiation et expansion clonale Contrôle de l infection et contraction clonale Mémoire (hétérogénéité)
3 Mémoire immunologique Immunité cellulaire anti-tb Plus grande fréquence des clones spécifiques ~ 1/ Meilleur performance forte affinité de leur immunorécepteur seuil de déclenchement de leur activation plus facilement atteint (dose moindre d Ag) moindre exigence en signaux de costimulation sensibilitéétendue aux différentes cytokines capables d induire leur prolifération (IL-2, IL-7, IL-15) fonction effectrice rapidement opérationnelle présence au sein même des tissus périphériques O Garra A et al. Ann Rev Immunol 2013 Réponse cellulaire TH1 anti-tb Facteurs indispensables pour le contrôle de la tuberculose (réponse TH1) IL-12 LT CD4 IFN-γ TNF-α Autres acteurs LT CD8 LTγδet inkt (reconnaissance de antigènes lipidiques) LB (rôle mineur des Abs) Tuberculose active et latente Le développement de la maladie active (et sa sévérité) est multifactoriel (interactions entre l hôte, l environnement et le bacille) Facteurs de risque connus Co-infection VIH et autres immunodéficiences, diabètes Malnutrition et pauvreté Equilibre entre facteurs protecteurs IFN-γ, TNF-α, apoptose, TH1 et délétères de la réponse immunitaire Treg, IL-10, nécrose, immunopathologie de l inflammation exacerbée (IL-17 et neutrophiles) Influence de la souche et quantitédu bacille, polymorphismes génétiques chez l hôte, co-infections
4 Comment éradiquer la tuberculose? Les nouveaux cas de TB sont générés par le réservoir de TB latente. Il faut éliminer ce réservoir infectieux. TB active 9 millions de nouveaux cas par an -Malheureusement et uniquement la partie émergée de l iceberg! Justification de l approche immunologique cellulaire T M. tuberculosis : pathogène intracellulaire, difficile àdétecter et àisoler chez les patients infectés Cette «épidémie masquée»de personnes infectées par la TB latente est énorme. La croissance de la TB latente devient une «bombe àretardement» clinique. Il faut désamorcer cette bombe en dépistant et traitant les TB latentes. - risque de réactivation divisé par 10 - mais effets adverses du traitement TB Latente - Épidémie masquée -2 milliards de personnes infectées La réponse humorale aux infections àm. tuberculosis est faible L infection àm. tuberculosis induit une forte réponse immunitaire de type Th1 Les cellules T sécrétrices d interférongamma spécifiques de M.tuberculosis pourraient être un marqueur spécifique de l infection Test diagnostic cutané pour TB latente Le diagnostic de la tuberculose latente repose sur un test cutanédéveloppéil y a 100 ans : l IDR (intradermoréaction) C est le test diagnostic le plus ancien encore utilisé. Spécificitéfaible: réactions croisées entre l IDR et le BCG et/ou les mycobactéries environnementales Sensibilitéinsuffisante : 75-90% pour les TB actives plus faible pour les TB disséminées ou les infections HIV, inconnu pour les TB latentes Besoin de 2 visites : l injection puis la lecture de l induration 2 jours après Variabilité selon l opérateur (inoculation & lecture) Standardisation du réactif Inflammation & cicatrisation douloureuses Bases immunologiques Des cellules T Des cytokines Une réponse immunologique in vivo (IDR) Réponse immunologique in vitro Dosages de cytokines Elisa, Elispot IGRAs = Interferon Gamma Releasing Assays De l IDR aux IGRAs?
5 Principe des IGRAs Méthodologie Culture cellulaire avec un pool de peptides des épitopes immunodominants des protéines du BK non présentes dans le BCG : CFP-10 et ESAT-6 Présentation par les molécules HLA de classe I et classe II (stimulation des Lymphos T CD4+ et CD8+) Quantification de la production d IFN-γ ELISA ELISPOT (Marquage intracellulaires des cytokines, cytométrie en flux) Methodology Introduction au test T-SPOT.TB Detects TB indirectly by measuring the response of TB-specific effector T cells Uses the generic ELISPOT technique Purified White Blood Cells (PBMCs) challenged with TB-specific antigens (ESAT-6, CFP10) The interferon gamma footprint of each reacting T cell produces a spot Spots are measured to give quantitative measure of the numbers of individual T cells reacting The test can also be used on nonblood samples To detect TB-specific T cells in specific body fluids (e.g. BAL, CSF) Results shown to help rule in active TB disease in that location Etape 1 Préparation des cellules Tube hépariné Séparation des cellules mononuclées par gradient de densité(ficoll) Recueil des lymphocytes, monocytes et cellules dendritiques Lavage et comptage Ajouter 2.5x10 5 cellules par puits Ajouter antigènes aux puits 4 puits différents : témoin négatif, témoin positif, panel A (ESAT-6), panel B (CFP-10) Incuber overnight Etape 2 Révélation des spots Lavage plaques Ajouter réactif détection pendant 60 minutes Lavage plaques Ajouter substrat; spots en 7 minutes Lavage et séchage des plaques -ve +ve
6 Etape 3 Comptage des spots Adaptable à la routine clinique Comptage des spots àl oeil, loupe, microscope Lecteur elispot automatisé Lecture standardisée Calcul du nombre de spots et mémorisation des données Automatisation possible des settings Technique simple +/-, rapide, automatisable +/-. Kits, équipements et logiciels validés selon standards internationaux. Robuste et reproductible. Adaptable àtout liquide biologique contenant des LT Exemples de résultats PHA vs Panel A, Panel B Un autre test IGRA: Quantiferon -TB Gold Principe similaire au TSPOT.TB Méthode sur sang total Prélèvement de sang directement dans 3 tubes: Tube négatif Tube Mitogène (PHA, contrôle +) Tube Ags TB : CFP-10, ESAT-6 ettb 7.7
7 QuantiFERON -TB Gold Critères pour le choix du test T-spot.TB Agitation vigoureuse des tubes (Ags sur la paroi) Incubation à 37 C overnight Centrifugation et recueil du plasma Quantification d IFNg plasmatique par ELISA Différence 1 Lavage (purification) et comptage Correction des lymphopénies ( cellules/puits) Critères pour le choix du test T-spot.TB Critères pour le choix du test T-spot.TB Différence 2 Production cytokinique au niveau cellulaire Pas de courbe standard Elisa Différence 3 Mesure de cellules T individuelles Ex: 1000pg IFNg/mL: 2 cellules produisant 500 pg chacune ou 1000 cellules produisant 1 pg chacune?
8 Critères pour le choix du test T-spot.TB Moins d influence de paramètres préanalytiques Tubes standards Pas d agitation particulière Pas d ordre de prélèvement des tubes Pas de tubes trop ou pas assez remplis Pas d influence de l attente pré-incubation Plus facile pour accréditation maîtrise à100% du test par le laboratoire Critères pour le choix du test T-spot.TB Purification, Standardisation et comptage Cytokines ou médicaments (immunosuppresseurs) plasmatiques éliminés de l incubation avec l Ag. Diminution du «bruit de fond»cytokinique. Pas d interférence avec l activation lymphocytaire T Correction des lymphopénies ( cellules/puits) Résultats standardisés permettant le monitoring longitudinal des fréquences de lymphocytes spécifiques : avant après traitement (antituberculeux, anti-tnf, ) Possibilitéde réaliser l analyse dans les liquides contenant de lymphocytes T (LBA, ascite, ) Sensibilité accrue D après la littérature au moins 10% de plus (?) Expérience du Laboratoire d Immunologie CHU de Nancy Brabois -Depuis juin Sources des prélèvements - Luxembourg (dans la journée) - Région (dans la journée) -CHU -Séries patients par jour, -~2000/an -du lundi au jeudi Expérience nancéienne Services De 2004 à2007 Rhumatologie Depuis 2007 Rhumatologie CLAT Tous services cliniques (Gastroentérologie, Maladies Infectieuses, Médecine Interne, Dermatologie, Réa ) Médecine du Travail Indéterminés ~7% (5% ctrl PHA négatif et 2% témoin négatif réactif) Positifs 17,5%
9 Haut Conseil de la Santé Publique Avis relatif àl utilisation des tests de détection de la production d interféron-g Ne doivent être utilisés que pour le seul diagnostic de l infection tuberculeuse latente et uniquement dans l objectif de la traiter Pas indiqués dans le diagnostic de la tuberculose maladie, mais aide dans certains cas de diagnostic difficile chez l enfant (<5 ans) Formes pauci-bacillaires Chez l adulte en cas de certains cas de TB extra-pulmonaire Haut Conseil de la Santé Publique Avis relatif àl utilisation des tests de détection de la production d interféron-g Diagnostic de l infection tuberculeuse latente Dépistage d infections récentes enquêtes autour des cas Dépistage des infections anciennes réactivation par l immunodépression avant mise sous traitement par anti-tnf alpha patients infectés par le VIH Dépistage et surveillance migrants récents et personnels de santé. Perspectives Évaluation de l immunitéanti-tuberculose avant et après traitement Comparaison cytokines intracellulaires par cytométrie en flux et ELISPOT Challenge = différencier tuberculose active et latente Évaluation de la sécrétion de cytokines par marquage intracytoplasmique Évaluation globale de l immunité cellulaire T Complémentaire et plus informative que la recherche par ELISPOT de lymphocytes T sécrétant IFNg (la réponse IFNg isolée n est pas suffisante pour évaluer la magnitude et la présence ou absence d une immunité spécifique vis-à-vis des pathogènes) Développement de nouvelles pistes dans le management clinique des infections
10 Évaluation des lymphocytes spécifiques de M. tuberculosis Analyse Sélection des sous populations lymphocytaires T CD4+ et CD8+ et de mémoire Culture cellulaire avec l Ag Cellules : PBMC Antigène Pool de peptides des épitopes immunodominants CFP-10 et ESAT6 (15aa, overlap de 11 aa) présentation par les molécules HLA de classe I et classe II stimulation des lymphocytes T CD4+ et CD8+ Contrôles négatif (milieu seul) et positif (mitogène) Culture overnight Phénotypage et acquisition au cytomètre en flux Réponses polyfonctionnelles Conclusion IGRAS Aide au diagnostique de la TB latente Suivi «longitudinal»? Après traitement par anti-tnf? Après traitement anti-tb? Place à l évaluation globale de l immunité anti-tb (réponses polyfonctionnelles)
11 T-spot.TB vs. Quantiferon -TB Gold avantages et inconvénients T-spot.TB vs. Quantiferon -TB Gold avantages et inconvénients Pré-analytique T-spot.TB Pas de tubes spécifiques Pas de manipulations ou volumes sanguins particuliers Quantiferon-TB Gold Tubes spécifiques Ordre de prélèvement (?) Volumes sanguins particuliers Agitation particulière des tubes Analytique T-spot.TB Correction des lymphopénies Résultats quantitatifs (cellules individuelles) Possibilitéd évaluer autres liquides biologiques (LBA, ) Plus grande technicitérequise (personnel et matériel) Coût plus élevé(bhn 400) Quantiferon-TB Gold 3 antigènes Technicité plus simple Moindre coût (BHN200) T-spot.TB vs. Quantiferon -TB Gold avantages et inconvénients Post-analytique T-spot.TB Possibilitéd un rendu des résultats rapide (24hs) Plus d information (nombre de cellules positives): résultats standardisés permettant le suivi longitudinal Quantiferon-TB Gold Attente pour remplir une plaque Elisa avant de rendre les résultats
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