Détection et quantification des LT spécifiques d haptd par ELISPOT IFN-γ

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1 Détection et quantification des LT spécifiques d haptd haptène médicamenteux m par ELISPOT IFN-γ -Inserm U 503, Equipe 3 - Aurore Rozières, Anca Hennino, Marc Vocanson, Karen Rodet, JF Nicolas -U.F. Immunologie Clinique et Allergologie CH Lyon Sud - Frédéric Bérard, Nathalie Gunera-Saad, JF Nicolas -Plateforme d Immunomonitorage CH Lyon-Sud - Aurore Rozières, Marie-claude Gutowski, Danièle Gaujac, Grégoire Cozon, Jacques Bienvenu

2 Manifestations Cliniques

3 Diagnostic Patch-tests

4 L intérêt d un d test biologique d HSR d aux médicamentsm Diagnostic basé sur la pratique de tests cutanés: 1- Accessibilité à un centre d allergie d au médicament m (peu de centres en France; hospitalisation des patients ) 2- Effets secondaires : sensibilisation 3- Aide dans les cas d interprd interprétation tation des tests difficiles

5 Situation du problème Maladies inflammatoires dues à des Lymphocytes T spécifiques du médicaments Gerber BO, Pichler WJ, Cellular mechanisms of T cell mediated drug hypersensitivity, Current Opinion in Immunol, : Présence de LT CD4+ et CD8+ spécifiques du médicament en cause dans le sang périphérique des patients Activation of drug CD4+ and CD8+ T cells in individuals allergic to sulfonamides, phenytoin and carbamazepine, J Immunol, 1995 Jul 1;155(1): Rôle de IFN-γ A. Rozieres, K. Rodet, S. Bosset, F. Berard,G. Cozon, J. Bienvenu, JF.Nicolas CD8+ T cell involvement in maculo-papular exanthema to amoxicillin (en cours de rédaction) Padial A, Posadas S, Alvarez J, Torres MJ, Alvarez JA, Mayorca C, Blanca M, Allergy 2005 May 60(5): Gene expression levels of cytokines profile and cytotoxic markers in non-immediate reactions to drugs, Blood cells disease 2002 Oct:

6 LT CD8+ IFN-γ+ + sont impliqués s dans le développment des réactions r d allergied A CD 3 CD NS NT 10h 48h 10h 48h 10h 48h 10h 48h 10h 48h Negative Skin Patch-test CD8 IFNγ Actine NT NS % DO CD8/ DO Actine % DO IFNγ/ DO Actine

7 Tests Biologiques : Test de Transformation Lymphocytaire / ELISPOT IFN-γ

8 Les tests biologiques actuels Test de Transformation Lymphocytaire: Sang hépariné Ficoll PBMC Médicament 1 Médicament 2 Index de stimulation (SI) = cpm avec l antigl antigène ne / cpm sans l antigènene émoin négatif Témoin positif 5 jours RPMI % sérum autologue Avantages: -Mesure de la prolifération 12h Ajout Thymidine Tritiée -Inconvénients: -Sensibilité moyenne ( 60-70% β- lactams -Utilisation de radioactivité -5 jours de culture Mesure de l incorporation de thymidine

9 Test biologique testé Test ELISPOT : technique permettant la numération, même pour de très s faibles fréquences de cellules spécifiques d un d haptène ou d un d peptide.

10 TEST ELISPOT IFN-γ anti-ifn-γ Médicament anti-ifn-γ Avantages: -Méthode rapide -Bonne sensibilité -Quantification du nombre de cellules productrices d une cytokine

11 Comparaison ELISPOT IFN-γ / Test de Transformation Lymphocytaire IFN-γ SFC/ PBMC Amox-DTH Amox-tolerant Amox 1mg/ml Amox-IHS - Sensibilité : 91% - Specificité : 95% Amox-DTH Amox-tolerant Ceft. 1mg/ml Amox-IHS Stimulation Index Amox-DTH Amox 1mg/ml Amox-tolerant Amox-IHS Amox-DTH Ceft. 1mg/ml Amox-tolerant Amox-IHS - Sensibilité : 68% - Spécificit cificité : 95%

12 Analyse de la corrélation entre ELISPOT IFN-γ / Test de Transformation 7.5 Lymphocytaire Stimulation Index IFN-γ SFC/ PBMC

13 Analyse de la corrélation entre délai d depuis l accidentl / Test biologique Delay between allergic reaction and biologic test (year) Stimulation Index Delay between allergic reaction and biologic test (year) IFN-g SFC/ PBMC

14 DETECTION DES REACTIVITES CROISEES AVEC LE TEST 3 ELISPOT IFN-γ Index de stimulation 2,5 2 1,5 1 0,5 0 IFN-γ SFC / PBMC Ticarcilline Totapen Penglobe Peni G Ceftriaxone Ticarcilline Réactivités Ticarcilline / Totapen / Penglobe / Penicilline G : Contre- indication de ces médicaments Totapen Penglobe Peni G Ceftriaxone Prescription de Ceftriaxone (Rocephine )

15 Conclusions - l ELISPOT IFNγ permet la numération in vitro de la réponse r T spécifique d amoxicillined -l ELISPOT IFNγ semble discriminer les patients allergiques aux médicaments des patients non allergiques -L intérêt de cette technique réside, r outre dans sa simplicité de mise en oeuvre, dans le nombre important de molécules médicamenteuses pouvant être testées simultanément ment et la rapidité d obtention du résultatr sultat

16 Mise en place de ELISPOT IFN-γ / IL-5 5 (1) anti-ifn-γ Médicament anti-ifn-γ

17 Mise en place de ELISPOT IFN-γ / IL-5 5 (2) anti-ifn-γ + anticorps anti-il-5 Médicament anti-ifn-γ + anti-il-5

18 TRANSFERT TECHNOLOGIQUE Fondamental Clinique LABORATOIRE IMMUNOLOGIE UF Allergie et immunomonitorage Centre Hospitalier Lyon Sud

19 Nombre de tests réalisés BILAN ACTIVITE tests réalisés / 86 patients ( 28 janvier au 31 décembre ) Janvier 5 tests réalisés Février 7 tests réalisés Mars 6 tests réalisés Avril 3 tests réalisés Mai 8 tests réalisés Juin 21 tests réalisés Juillet 21 tests réalisés Septembre 34 tests réalisés Octobre 19 tests réalisés Novembre 25 tests réalisés Décembre 32 tests réalisés

20 Nombre de tests réalisés BILAN ACTIVITE tests réalisés / 131 patients Janvier 63 tests réalisés Février 51 tests réalisés Mars 25 tests réalisés Avril 31 tests réalisés Mai 16 tests réalisés Juin 28 tests réalisés Juillet 28 tests réalisés

21 Répartition des demandes (1) 2% Sulfonamides B-lactamines Héparine 49,5% Insuline Paracetamol carbamazépine 3% 2,5% 6% Divers

22 Répartition des demandes (2) 5% 6% Amoxicilline ceftriaxone 34% Peni G Piperacilline 34% Oxacilline Cloxacilline

23 Remerciements INSERM U503 RODET Karen HENNINO Anca BONNEVILLE Marlène CHAVAGNAC Cyril VOCANSON Marc TEDONE Rosine BENETIERE Josette DUCLUZEAU Marie-Thérèse UF Immunologie et allergologie clinique Centre hospitalier Lyon Sud NICOLAS Jean-François BERARD Frédéric BIENVENU Jacques SAAD-GUNERA Nathalie GUILLOT Isabelle Laboratoire d immunologie clinique Centre hospitalier Lyon Sud BIENVENU Jacques COZON Gregoire GUTOWSKI Marie-Claude GAUJAC Danièle

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