Mesure de l activité enzymatique

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1 Mesure de l activité enzymatique - dans cette section, nous traiterons des aspects plus pratiques de la mesure de l activité d une enzyme A. Principes de base - l activité enzymatique est influencée à la fois par des propriétés spécifiques à l enzyme (concentrations des substrats, activateurs, et inhibiteurs) et par des effets non spécifiques, soit: des sels et tampons, ph, force ionique, température, et dans certain cas d autres protéines - typiquement, les conditions sont arrangées pour que l enzyme ait une activité maximale (V max ) A.1 Concentration de substrat, activateurs, inhibiteurs. - de règle générale, la mesure de l activité d une enzyme demande des concentrations élevées de substrat qui sont parfois difficiles à atteindre - si l enzyme obéit à la cinétique Michaelis-Menten, une concentration de substrat dépassant 10 X le K m doit être utilisée (Figure 1A) - à cette concentration de substrat, la vitesse mesurée représente 91% de la vitesse à concentration infinie; des complications apparaissent si une concentration faible de substrat est utilisée (Figure 1B)

2 A B [Produit] [Substrat] Temps Effet de la consommation de substrat sur l activité enzymatique: (a) relation entre la vitesse et la concentration de substrat ; (b) vitesse observée en fonction du substrat transformé en produit, lorsque [substrat] = 10 Km (ligne solide) et [substrat] = 2 Km (ligne pointillée) Figure 1

3 - considérant que toutes les déterminations de l activité prennent un certain temps à être complétées, il est important que la vitesse soit linéaire pendant la période d incubation utilisée pour détecter convenablement la formation du produit de la réaction - s il y a accumulation du produit, la vitesse de la réaction peut être compromise par la réaction de retour (retro-inhibition). Plusieurs stratégies peuvent être utilisées, qui incluent : 1. mesurer la réaction enzymatique pour une courte durée afin de minimiser l accumulation du produit 2. l utilisation de hautes concentrations de substrat, 3. des ph non physiologiques (s il s agit d un proton) pour enlever le proton et déplacer la réaction dans la direction de produit, 4. l utilisation de méthodes très sensibles pour détecter le produit afin de minimiser sa concentration - l inhibition par le substrat à des hautes concentrations peut aussi être due à la formation d interactions non appropriées au site actif et qui mènent à l inhibition de l activité enzymatique

4 A.2 Effets du ph, de la Force Ionique et de la Température - les valeurs de V max et K M sont influencées par le ph, la force ionique, et la température le ph - la valeur maximale de l activité de certaines enzymes peut être très loin du ph physiologique - par exemple, la phosphatase alcaline possède une activité maximale à ph Cependant, son K M est plus bas à ph 7 qu à ph 10-11; ceci est important afin de comparer les activités entre les essais avec des conditions différentes le tampon/force ionique - certains tampons peuvent agir comme inhibiteurs - par exemple, le phosphate et certaines tampons anioniques, possédant des charges multiples tel que le citrate, compétitionnent avec des substrats possédant des charges négatives pour lier le site actif - puisque les concentrations de tampon sont souvent élevées, entre 10 et 100mM, même une association faible par le tampon peut provoquer une inhibition importante - des ions métalliques, essentiels pour l activité, peuvent être complexés par des tampons tels que le citrate et l imidazole, et compromettre l activité enzymatique

5 - la force ionique physiologique est entre M; les enzymes sont très souvent moins actives à une force ionique inférieure par rapport à la valeur physiologique la température - la température en soit n est pas une propriété essentielle mais elle intervient en ce qui concerne le temps d incubation - la vitesse d une réaction augmente en règle générale d un facteur 2 pour chaque 10 C - cependant, à de hautes températures, même si la température augmente la vitesse d une enzyme, l enzyme peut être dénaturé pendant la période d incubation de l essai - plus la période d incubation est courte, plus la température apparente de l activité maximale peut être élevée puisqu il y a moins de temps pour que l enzyme dénature - la température de référence et celle choisie est très souvent est 25 C mais la température physiologique 37 C est fréquemment utilisée

6 A.3 Mesure de l activité enzymatique par méthodes discontinues - la mesure de l activité d une enzyme dépend d une méthode qui détermine la quantité de produit généré durant la réaction; - ceci peut impliquer la séparation du produit et du substrat après la réaction s il est impossible de doser le produit en présence du substrat - il y a deux façons de mesurer l activité enzymatique : 1) par des méthodes discontinues (flot arrêté) 2) par des méthodes continues - les méthodes discontinues possèdent l avantage qu elles peuvent s appliquer à n importe quel système enzymatique - avec une méthode discontinue, l enzyme est incubé avec ses substrats pendant une certaine période de temps et la réaction est ensuite arrêtée. - le produit est dosé et son évolution est assumée linéaire pendant la période de l incubation

7 - une des premières choses à vérifier est l évolution linéaire de la réaction ->une seule donnée peut sous-estimer la vitesse initiale dû à des temps d incubation trop longs Produit Vraie vitesse initiale à l état stationnaire Arrêt de la réaction enzymatique Vitesse mesurée Temps - également, un délai dans la réaction peut sous-estimer la vitesse à partir d un seul point - il est essentiel de faire plusieurs incubations à des temps différents afin de vérifier si la réaction est linéaire - ceci est très important dans le cas d extraits à partir d une lyse cellulaire à cause de la possibilité de réactions secondaires - par exemple dans un extrait contenant l enzyme subséquent dans une voie métabolique, une autre enzyme consume le produit qu on veut mesurer

8 A.3.1 Conditions d incubation. - il n y a pas des contraintes véritables en ce qui concerne des conditions d incubation - l échantillon contenant l enzyme est ajusté à temps zéro et rapidement mélangé; la réaction est incubée pendant des temps fixe et ensuite arrêtée. - la réaction est arrêtée par une méthode qui provoque la dénaturation instantanée de l enzyme ou déplace l équilibre de la réaction afin que l enzyme ne soit plus active - les méthodes souvent utilisées sont la précipitation par acide trichloracétique ou perchlorique ou par dénaturation thermique de l enzyme - on peut également utiliser le SDS pour dénaturer l enzyme - la réaction peut être arrêtée également par des méthodes non dénaturantes qui inactivent l enzyme - i.e. changement de ph, ajout d EDTA si des ions métalliques sont essentiels, dilution avec un substrat non-radioactif si un produit marqué par un isotope radioactif est mesuré

9 A.3.2 Mesure du produit. - la mesure du produit par des méthodes enzymatiques est très souvent employée plusieurs produits de réactions enzymatiques peuvent être difficile à détecter - une approche utilisée pour les détecter est de convertir le produit directement ou indirectement en un autre produit qui lui est plus facile à détecter - les techniques de détection utilisées le plus fréquemment sont la spectrophotométrie ou la fluorométrie Figure montrant le principe de la spectrophotométrie

10 - le but de ces méthodes est que la détection du produit final dépend de la production d un chromatophore ou fluorophore important et qui est facile à détecter. Les approches utilisées sont : 1) la détection directe un des produits de la réaction enzymatique absorbe la lumière, par exemple, la formation de NADH par réduction de NAD + (le NADH absorbe la lumière à 340 nm et émet de la fluorescence à 450 nm) (a) Spectre d absorption du NADH, comparé avec celui du NAD + (b) Spectre d émission de fluorescence du NADH, avec excitation à 365 nm

11 2) détection indirecte ajoute une enzyme qui utilise le produit de la réaction pour former du NADH par couplage avec une autre réaction. - méthode par essais couplés P r oduit P Temps Première incubation Fo rmation de R Principe de mesure du produit par essai couplé Échantillon pris pour mesurer [P] Enzymes couplées Réaction observée - pour cette approche, il est essentiel que la réaction couplée détecte de façon stœchiométrique la formation du produit original (une molécule de P produit une molécule de R) Deuxième incubation Temps

12 - la formation d un produit possédant un chromatophore représente une autre approche; par exemple, la formation de nitrophénolate qui absorbe à 400 nm. - des techniques comme la chromatographie peuvent être utilisées afin de séparer les réactants (substrats et produits) avant qu ils soient dosés. - la figure suivante montre l utilisation d un essai couplé afin de déterminer la concentration de glucose sanguin - les enzymes utilisés sont la glucose oxydase (enzyme P) et la peroxydase (enzyme Q) qui donne lieu à un produit coloré vert détecté par spectrophotométrie Détermination enzymatique du glucose

13 A.4 Mesure de l activité enzymatique par méthodes continues - les méthodes continues impliquent que le progrès de la réaction soit observé pendant toute la réaction et généralement de façon instantanée - il y a un nombre important d enzymes dont l activité peut être suivie directement grâce à la différence en absorbance ou fluorescence entre le produit et le substrat LDH lactate pyruvate NAD NADH (ncat= nombre d unité catalytique) Détermination de l activité de la lactate-déshydrogénase (LDH) par spectrophotométrie

14 - les catégories d enzymes dont ont peut mesurer l activité en méthode continue sont: - les déshydrogénases qui utilisent NAD ou NADP, - les hydrolases qui peuvent utiliser des substrats synthétiques qui libèrent des produits colorés ou fluorescents - polymères endohydrolases qui par leur activité réduisent la viscosité d un polymère A.4.1 Méthodes couplés. - le principe de la méthode couplée est comme celui de l essai couplé où le produit qui ne peut pas être observé directement est transformé chimiquement ou enzymatiquement en un composé qui peut être observé - mais en méthode continue, les réactants utilisés doivent fonctionner sous les conditions de la réaction enzymatique à mesurer - dans la mesure de la vitesse de la réaction, la vitesse de transformation du produit par le système d enzyme couplé ajouté doit être suffisante afin de suivre quantitativement la formation du produit - une réponse linéaire par le système d enzyme couplé assure le couplage quantitatif avec la formation du produit de l enzyme d intérêt - réponse linéaire veut dire que l activité mesurée par le système couplé augmente de façon proportionnelle avec la quantité d enzyme utilisé dans l essai