Les différentes structures des protéines

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1 Les différentes structures des protéines tructure primaire tructure secondaire -Ala-Glu-Val-Thr-Asp-Pro-Gly- -AEVTDPG- Hélice Feuillet tructure tertiaire tructure quaternaire Domaine. Lacombe 1 Les différentes structures des protéines structure primaire : suite ordonnée de résidus d acides aminés liés par des liaisons peptidiques (= séquence) structure secondaire : conformation spatiale répétitive régulière de segments de la chaîne protéique (hélice, feuillet ) structure tertiaire : conformation biologiquement active (dite native) d une chaîne polypeptidique repliée en une structure tridimensionnelle. structure quaternaire : structure dans l espace adoptée par l association d au moins deux chaînes polypeptidiques distinctes en un multimère protéique.. Lacombe 2 1

2 Les protéines Une protéine est caractérisée par le nombre de résidus d acides aminés qui la composent la nature des résidus l ordre de succession des résidus eux-ci sont reliés par la liaison peptidique La masse moléculaire des protéines s exprime en Da (daltons) et varie d 5000 Da pour les plus petites à Da pour les plus grosses. Un résidu d acide aminé ayant une masse moléculaire d 120 Da, on peut facilement évaluer le nombre d acides aminés formant une protéine à partir de la masse moléculaire de celle-ci.. Lacombe 3 I - tructure primaire R 1 Liaison peptidique R 2 R 1 R 2 H H H H 3HN - 3HN - 3HN NH - Exemple : Résidu aminoterminal H 3 H 2 H H 2 H Liaison peptidique H NH H NH - 3HN H NH H 2 Ala er ys Gly Alanyl éryl ystéinyl Glycine AG Résidu carboxyterminal. Lacombe 4 2

3 Techniques de purification d une protéine * Précipitation fractionnée * entrifugation * hromatographies * Dialyse * Électrophorèse sur gel de polyacrylamide * Isoélectrofocalisation * Électrophorèse bidimensionnelle. Lacombe 5 Techniques de purification d une protéine * Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de D (D-PAGE) Le D (odium Docécyl ulfate) dénature les protéines et les charge négativement. éparation des molécules en fonction de leur masse, les plus petites migrent plus loin dans le gel (plus près de l anode).. Lacombe 6 3

4 L électrophorèse sur gel L électrophorèse Le gel va ralentir la migration des grosses molécules. athode Dépôt de l'échantillon Plaques de verre entre lesquelles le gel a été coulé Anode. Lacombe 7 L électrophorèse L électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de D (D-PAGE) PM kda - éparation des molécules en fonction de leur masse, les plus petites migrent plus loin dans le gel (plus près de l anode) Lacombe 8 4

5 = Techniques de purification d une protéine * Électrophorèse bidimensionnelle: un gel de polyacrylamide sur lequel a été réalisé une isoélectrofocalisation (IEF) est déposé au-dessus d un gel de polyacrylamide-d (D-PAGE). Les protéines sont ainsi séparées dans la première dimension en fonction de leur phi et dans la deuxième dimension en fonction de leur PM. I : IEF Extrémité basique Extrémité acide phi II : D-PAGE. Lacombe 9 phi PM *Rupture des ponts disulfures - oxydation par l acide performique H - H H 2 - H H H Pont disulfure acide performique 2 H - H Acide cystéique Inconvénients : les résidus Met sont oxydés (en méthionine sulfone) et le Trp est détruit. Lacombe 10 5

6 *Rupture des ponts disulfures - réduction par le 2-mercaptoéthanol H - H H 2 - H 2 H - H 2 - H 2 - H Pont disulfure 2-mercaptoéthanol - H 2 - H 2 H - H 2 - H - H 2 - H ystéine 2-mercaptoéthanoldisulfide. Lacombe 11 *Rupture des ponts disulfures - réduction par le dithiothréitol H - H H 2 - H HH 2 - (HH) 2 - H 2 H Pont disulfure dithiothréitol H 2 H - H 2 - H ystéine H. Lacombe 12 6

7 *Protéolyse Bromure de cyanogène (BrN) provoque la rupture de la liaison peptidique après Met... NH - H - - NH - H - - NH - H -.. Ri H 2 H 2 H 3 Méthionine Ri 2... NH - H - - NH - H - Ri H 2 H 2 Homosérinelactone NH - H Ri2. Lacombe 13 *Protéolyse Trypsine hydrolyse la liaison peptidique côté de Lys (K) et Arg (R) hymotrypsine hydrolyse la liaison peptidique côté de Tyr (Y), Phe (F) et Trp (W) La protéase V8 de treptococcus aureus hydrolyse la liaison peptidique côté de Asp (D) et Glu (E) (seulement de Glu dans certaines conditions de tampon). Lacombe 14 7

8 *éparation des peptides hromatographies Électrophorèses Finger-print (électrophorèse à ph 6,4 suivie d'une chromatographie dans un sens perpendiculaire, réalisée à l'aide d'une phase mobile organique). Lacombe 15 *Analyse de chaque peptide Hydrolyse acide totale : Hl 6N, 24 heures, 100 rupture de toutes les liaisons peptidiques MAI destruction du Trp (W)! et transformation Asn (N) Asp (D) et Gln (Q) Glu (E) par hydrolyse de la fonction amide Détermination de la composition en acides aminés chromatographie par échange d ions et coloration à la ninhydrine. Lacombe 16 8

9 A 570 nm D T E G V Y F H K A M I L R hromatographie par échange d ions NH 3 A 440nm P. Lacombe 17 rdre de sortie des acides aminés avec un tampon de ph ph Réaction d un acide aminé avec la ninhydrine (chéma simplifié) 3HN H H 2 R H H ninhydrine Pourpre de Ruhemann* = 570 nm NH RH 2 * Dans le cas de la proline, le composé coloré absorbe à 440 nm. Lacombe 18 9

10 Détermination de l extrémité N-terminale * aminopeptidase : hydrolyse sélectivement la première liaison peptidique (puis la deuxième, etc) * réaction d Edman (qui permet un séquençage) N Phénylisothiocyanate (PIT) NH2 N H - H H R1 Phénylthiohydanthoïne Acide aminé Phénylthiocarbamyl AA (PTH-Aa identifié par chomatographie) Détermination de l extrémité -terminale * carboxypeptidase : hydrolyse sélectivement la dernière liaison 19 peptidique (puis l avant-dernière etc) NH H R1 N NH H R1 10