3.3. La dégénérescence cortico basale (DCB).19

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1 Table des matières I. Introduction 8 1.Aspects cliniques de la maladie d Alzheimer Diagnostic clinique Aspects épidémiologiques Aspects génétiques Lésions neuropathologiques de la maladie d Alzheimer Diagnostic neuropathologique Les dégénérescences neurofibrillaires (DNF) Aspects morphologiques Distribution cérébrale Autres maladies neurodégénératives où sont observées des DNF 2.3. Les plaques séniles Aspects morphologiques Distribution cérébrale Autres maladies avec des dépôts d amyloïde 2.4. Autres lésions Perte neuronale Gliose La dégénérescence granulovacuolaire (DGV) 3. Les tauopathies Maladie de Pick La paralysie supranucléaire progressive (PSP) La dégénérescence cortico basale (DCB) La démence frontotemporale (DFTP-17).20 4.Le cytosquelette..20

2 4.1. Microtubules Filaments intermédiaires Microfilaments Les protéines Tau Gène Protéines Structure Localisation 5.3. Modifications post traductionnelles de la protéine tau Phosphorylation de tau Glycosylation Oxydation 5.4. Fonction Mutations de tau Les protéines PHF-Tau Définition Composition en isoformes de tau Modifications post-traductionnelles des protéines tau-phf Phosphorylation Ubiquitination Glycosylation Glycation 7. Les protéines présénilines 1 et Gène Protéines Structure

3 Localisation cellulaire 7.3. Fonction Mutations La protéine précurseur du peptide amyloïde Gène Protéine Structure Localisation cellulaire Métabolisme La voie non amyloïdogène La voie amyloïdogène Cheminement de l APP dans la cellule Le peptide amyloïde Aβ Transport axoplasmique 8.3. Fonction Mutations L apolipoprotéine E Gène Protéine Fonction Relation entre apolipoprotéine E et la maladie d Alzheimer Les modèles transgéniques de la maladie d Alzheimer Modèles d amyloidose Aß Modèles de dégénérescences neurofibrillaires Modèles transgéniques exprimant des isoformes de protéine tau humaine «sauvage» Modèles exprimant des isoformes de protéine tau mutée 4

4 II. Objectifs 47 III. Matériel et Méthodes Tissus humains Préparation des tissus Caractérisation neuropathologique 51 2.Souris transgéniques Description des transgènes Etablissement des lignées Préparation des tissus Cultures cellulaires Technique de culture des cellules CHO Technique de transfection Etablissement des lignées stables Anticorps Anticorps primaires Anticorps polyclonaux anti-tau Anticorps monoclonaux et polyclonaux anti-phosphotau Anticorps anti-ps Anticorps anti-app Anticorps Anti-Aβ 4.2. Anticorps secondaires Extraction d ARN Gel d agarose Extraction d ADN Electrophorèse sur gel des acides nucléiques PCR PCR-Tau... 59

5 9.2. PCR-PS PCR-APP PCR-ApoE RT-PCR RT-PCR Tau RT-PCR Actine Préparation des protéines Homogénats Préparation des protéines tau Préparation des protéines PS Immunoprécipitation des protéines tau Principe Technique Electrophorèse sur gel des protéines Immunoblotting des protéines Méthode TUNEL Principe Protocole Fixation des tissus Colorations Hématoxyline éosine Imprégnation argentique de Gallyas Rouge Congo Immunohistochimie Simple marquage chromogénique Double marquage chromogénique. 64

6 18.3. Double marquage en fluorescence Triple marquage Microscopie électronique IV. Résultats Effets de la surexpression d une forme mutée de PS1 sur la phosphorylation de tau et son agrégation dans un modèle double transgénique Résumé But du travail Résultats Génotypage des souris transgéniques Expression de la protéine tau transgénique Expression de la protéine préséniline 1 (M146L) transgénique Analyse statistique Phosphorylation des protéines tau Expression de la β-caténine Immunoprécipitation Immunohistochimie 1.4. Discussion Anomalies du cytosquelette neuronal dans des souris transgéniques exprimant une protéine tau humaine et des formes mutées de PS1 et de l APP Résumé But du travail Résultats Génotypage par PCR Analyse par Western blot

7 Analyse immunocytochimique Formation des dépôts amyloïdes dans les souris tau /APP et tau/ps1/app Analyse de la phosphorylation de tau par immunocytochimie Modifications neuritiques associées aux dépôts d amyloïde Aβ Analyse ultrastructurale des plaques amyloïdes et des neurites dystrophiques Analyse de la phosphorylation de tau par Western blotting 2.4. Discussion Etude de l agrégation de tau dans des lignées cellulaires exprimant des formes mutées de tau Résumé But du travail Matériel et méthodes Les plasmides Préparation des bactéries compétentes Transformation des bactéries Préparation de stock de plasmides Culture et transfection des cellules CHO Immunoblotting Dosage et quantification des protéines 3.4. Résultats Sélection des clones stables Analyse par immunoblotting 3.5. Discussion Analyse du profil des ARNm de tau et des isoformes de protéines tau dans le tissu cérébral de sujets contrôles et de patients Alzheimer Résumé But du travail...129

8 4.3. Résultats Concentration en ARN total dans les régions cérébrales affectées et non affectées Amplification par RT-PCR du domaine 5 des ARNm de tau Amplification par RT-PCR du domaine 3 des ARNm de tau Déphosphorylation des protéines tau présentes dans la fraction soluble d homogénats cérébraux Analyse densitométrique Génotypage du gène ApoE 4.4. Discussion.140 V. Discussion générale Modèlisation transgénique des dégénérescences neurofibrillaires : comparaison entre les différents modèles Modèles surexprimant des protéines tau humaines non mutées Relations entre tau, PS1, GSK-3 βet β-caténine Modèles exprimant des protéines tau mutées Les dépôts d amyloïdes βinduisent-ils la formation des DNF? Modèlisation cellulaire de la phosphorylation de tau Etude de la phosphorylation de tau dans des modèles cellulaires Etude de l agrégation de tau dans des modèles cellulaires non neuronaux Analyse de l expression différentielle des isoformes de tau Effet des mutations de tau associées aux DFTP-17 sur l expression des isoformes de tau Distribution cérébrale des ARNm de tau et des isoformes de proteine tau dans des cas sporadiques de MA 160

9 3.3. Le génotype APOE des sujets contrôles et Alzheimer a-t-il un effet sur le profil d expression des ARNm de tau et des protéines tau? 161 VI. Perspectives.162 VII. Bibliographie Annexes...186

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