Recherche de produits dopants dans les milieux biologiques

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Arnaud Milot
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1 1 ère Journée de l Expertise Chimique à Lyon, 21 novembre 2013 Traitement et préparation des échantillons Recherche de produits dopants dans les milieux biologiques Corinne Buisson, Dr. Sc. Responsable Section Contrôle et Développement Chimie Département des analyses - afld

2 Sommaire 1- Le Département des analyses et ses missions 2- Procédures de dépistage rapide 3- Procédures de confirmation 4- Procédures d analyses spécialisées

3 Le Département des analyses et ses missions

4 1- Le département des analyses et ses missions Le département des analyses : seul laboratoire accrédité AMA en France pour les analyses antidopage accrédité COFRAC (ISO 17025) Analyses : 9000 échantillons urinaires à analyser par an 1500 échantillons sanguins (procédures particulières) Parcourt d un échantillon : 1 ère étape de dépistage rapide (screening) confirmation des suspicions (re-préparation de l échantillon) analyses spécialisées

5 1- Le département des analyses et ses missions L AMA : La liste des interdictions Les substances interdites : Les agents anabolisants Les hormones peptidiques, facteurs de croissance et substances apparentées Les béta-2-agonistes Les modulateurs hormonaux (inhibiteur de l aromatase, anti-œstrogènes ) Les diurétiques et autres agents masquant Les stimulants Les narcotiques Les cannabinoïdes Les glucocorticoïdes Les béta-bloquants Toute substance non approuvée pour une utilisation thérapeutique chez l homme

6 Les procédures de screening

7 2- Les procédures de screening Objectifs : composés différents à rechercher des propriétés physico chimiques différentes excrétés dans l urine sous différentes formes : libre, glucuro / sulfoconjugué concentrations en analytes variables Contraintes : temps : délais à respecter (10 j) nombre d opérateurs limité -> nombre de procédures limité exigences sur les méthodes d analyses : les MRPL matrice : urine -> complexe, volume limité outils d analyse à disposition (GC et LC-MS) capacité de traitement journalier : 70 éch

2- Les procédures de screening Exemples de caractéristiques physico-chimiques des composés à analyser : conséquence sur le traitement de l échantillon Anabolisants Hydrolyse enzymatique

8 2- Les procédures de screening Exemples de caractéristiques physico-chimiques des composés à analyser : conséquence sur le traitement de l échantillon Anabolisants Hydrolyse enzymatique (b-glucuronidase E. Coli) Testostérone glucuronide : Glucuro-conjugué Testostérone : apolaire Hydrolyse + SPE C18 Comportement similaire pour la plupart des anabolisants Stimulants Heptaminol : basique Extraction ph basique Modafinil acide Extraction ph acide Comportements opposés au sein d une même catégorie Répartition des composés par procédure selon : Forme excrétées propriétés physicochimiques

9 2- Les procédures de screening Appareils à disposition : LC-MS/MS : ESI +/-, colonne C8 GC-MS/MS : EI, colonne HP-5 MS Dérivation nécessaire Anabolisants MSTFA/NH 4 I/Dithioérythritol Testostérone Testostérone di TMS Répartition des composés par technique selon : - Capacité à se fragmenter - Compatibilité avec la colonne analytique - Contraintes normatives

10 2- Les procédures de screening 5 procédures de screening pour couvrir au maximum la liste des substances interdites Essai 1 : Immuno : Dosage par immunofluorescence des hormones peptidiques (LH, hcg) (pas de préparation particulière) Essai 2 : PS : recherche des polysaccharides par colorimétrie (ultra-filtration, lavage à l eau, hydrolyse acide) Essai 3 : LCH : recherche multi composés (sti, cortico, narco, cana, bb, antago, anabo, b2ago) (mise à ph, hydrolyse enzymatique, SPE C18 sur robot, évaporation) -> LC-MS/MS Essai 4 : LC : recherche multi composés (diu, bb, sti, anabo, narco) (pas d hydrolyse, extraction liquide liquide acétate d éthyle ph 5/14, évaporation) -> LC-MS/MS Essai 5 : ANABO : recherche d anabolisants principalement (mise à ph, hydrolyse enzymatique, SPE C18 sur robot, évaporation, dérivation) -> GC-MS/MS Couverture la plus large possible avec un minimum de procédures «rapides»

11 2- Les procédures de screening Evolution permanente de la liste : nouvelle catégorie de composés : Les facteurs de croissance (peptides de synthèse) - LLE impossible - SPE C18 non adaptée GHRP-6 Extractible par aucune des procédures précédentes Développement d une nouvelle procédure de screening : Mise à ph acide, SPE échangeuse de cations sur robot, évaporation -> LC-MS/MS

12 Les procédures de confirmation

13 3- Les procédures de confirmation Suspicion au screening -> étape de confirmation L échantillon est repréparé selon un protocole plus adapté Préparation d échantillon plus spécifique : - Purification plus poussée (lavages supplémentaires de la matrice) - Extraction améliorée (amélioration des rendements, des LOD) Outil analytique plus adapté : - changement de technique : GC LC - changement de colonne analytique si besoin Il n existe pas autant de méthode de confirmation que de molécule dans la liste des substances interdites

14 3- Les procédures de confirmation Exemple de procédure de confirmation vs procédure de screening Screening anabo Confirmation anabo Prise d essai 2 ml Prise d essai 1 à 2 ml Lavage matrice : SPE C18 (MeOH) Hydrolyse enzymatique (b-glu) Hydrolyse enzymatique (b-glu) Extraction : SPE C18 (TBME) Extraction : LLE n-pentane ph9 Concentration : évaporation Concentration : évaporation Dérivation Analyse GC-MS/MS Dérivation Analyse GC-MS/MS Analyse LC-MS/MS

15 3- Les procédures de confirmation Exemple de procédure de confirmation vs procédure de screening Screening Stimulants Confirmation Stimulants Prise d essai 3mL Prise d essai 2 ml Hydrolyse SHP (b-glu + arylsulfatase) Hydrolyse enzymatique (b-glu) Extraction : SPE C18 (TBME) Concentration : évaporation Extraction : SPE Clean Screen DAU Concentration : évaporation Dérivation : PFPA Analyse LC-MS/MS Séchage pour reprise solvant injection (cyclohexane / AE) Analyse GC-MS/MS

16 Les analyses spécialisées

17 4- Les analyses spécialisées Nécessité d avoir une purification encore plus poussée pour certaines analyses : Cas de l analyses par GC-C-IRMS des stéroïdes endogènes dans l urine Principe de l analyse GC-C-IRMS : - Séparation des composés d intérêt dans le GC - Combustion totale dans le four à combustion (C) - IRMS : détermination de la teneur en 13 C et en 12 C des composés analysés Purification poussée nécessaire afin de ne faire entrer dans le four qu un composé à la fois -> si coélution, les composés sont brulés ensemble -> mélange de la teneur en 13 C/ 12 C

18 4- Les analyses spécialisées Purification pour l analyse par GC-C-IRMS : Confirmation IRMS Prise d essai 8 à 16 ml Augmentation prise d essai pour augmenter le signal Lavage matrice : SPE C18 (MeOH) Hydrolyse enzymatique (b-glu) Extraction : LLE cyclohexane Solvant adapté aux stéroïdes endogènes HPLC semi préparative Collecte des composés d intérêt dans différentes fractions Concentration : évaporation Dérivation : acétylation Dérivation MSTFA non compatible avec la GC-C-IRMS Analyse par GC-C-IRMS

19 4- Les analyses spécialisées Nécessité d avoir une purification particulière pour certains composés : Cas de l analyse de l insuline dans l urine : Objectifs : -> analyser les analogues de l insuline à des concentrations de l ordre de quelques pg/ml Problèmatique : -> Kits ELISA pour le dosage de l insuline non utilisables car non spécifiques (pas de différentiation des analogues possible) Nécessité de combiner une préparation d échantillon sensible avec une technique analytique spécifique : Préparation : colonnes IAC Analyse : LC-MS/MS

20 4- Les analyses spécialisées Purification pour la recherche des analogues de l insuline dans l urine : Prise d essai 15 à 20 ml Augmentation prise d essai pour augmenter le signal Lavage matrice : SPE HLB (Eau/AcN, 2%aa) Extraction : IAC (antiinsuline) (H2O, 2%aa) Spécifique aux insulines (analogues + endogène) SPE HLB (Eau/AcN, 2%aa) Changement de solvant Elimination du PBS Concentration : évaporation Analyse par LC-MS/MS

21 Conclusion

22 Conclusion - Pré traitement de l échantillon nécessaire pour l analyse des produits dopants dans les milieux biologique - Indispensable pour certaines applications : Confirmation : être plus spécifique pour éviter les faux-positifs Analyses spécialisées GC-C-IRMS : analyse des molécules 1 par 1 Protéines faiblement concentrées en milieu urinaire - Finalement pas toujours indispensable pour le screening : Nouvelle tendance : le «dilute and shoot» : gains : temps de manipulation nombre d opérateurs nécessaire moins de réactifs et consommables

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