Bases cytologiques et notion de biologie moléculaire appliquées à l appareil respiratoire
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- Francine Dumais
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1 30/09/2015 CAUBIT Lucy D1 CR : Marozava Eugénie Appareil respiratoire Pr E.Kaspi 8 pages Bases cytologiques et notion de biologie moléculaire Plan : A. Bases cytologiques I. Spécimen II. Analyse cytologique III. Ex : pathologie pulmonaire non cancéreuse IV. Ex : pathologie pulmonaire cancéreuse B. Notion de biologie cellulaire et moléculaire : «les récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK)» I. Structure II. Activation III. Cascade de signalisation IV. RTK et cancer Les diapos sont sur l ENT. 1/8
2 A. Bases cytologiques Au laboratoire de biologie cellulaire, il y a une activité de diagnostic cytologique (=analyse au microscope des cellules présentes dans un liquide biologique, ce sont les cellules dissociées). I. Les spécimens broncho-pulmonaires Au laboratoire o peut étudier : Expectorations spontanée ou induite Ponction transpariétales du parenchyme pulmonaire (avec aspiration à l aiguille) Prélèvements recueillis par endoscopie bronchique. C est une technique qui vise à étudier l arbre respiratoire à l aide d un endoscope avec une caméra introduit par le nez ou par la bouche du patient. Elle permet de recueillir le matériel biologique par : Aspiration bronchique Brossage bronchique : liquide de rinçage de la brosse + brosse (CR : une petite brosse sera installé sur l'endoscope, après l'endoscopie la brosse sera mis dans le sérum physiologique et transporté au laboratoire) Lavage broncho-alvéolaire Cytologie de ponction (à l aiguille +/- écho-guidée) : adénopathies, parenchyme, masse. Ex : ponction transbronchique à l aiguille non échoguidée d un ganglion sous carénaire (aire 7) Liquides pleuraux. Récupérés soit par une ponction transpariétale soit par thoracoscopie. Les spécimens doivent être prélevés à l état frais et acheminés le plus rapidement possible à 4 C au laboratoire pour permette un échantillon de bonne qualité, ce qui permet une meilleure analyse cytologique. II. Analyse cytologique Une fois le prélèvement arrivé au laboratoire, il subit différentes étapes pré-analytiques : Étalement Spots de cytocentrifugation (CR : permettent de concentrer le liquide biologique sur des zones très limités de la lame). Colorations : o De may Grumwald Giemsa est untilé plutôt pour les cellules hématopoïétiques o Papanicolau pour les cellules non hématopoïétiques On utilise les 2 colorations car elles sont complémentaires. On retrouve différents types cellulaires : Cellules de l appareil respiratoire (aspiration, brossage, LBA): Cellules bronchiques ciliées ou mucipares (muco-sécrétantes). On met en évidence ou non la présence de battements ciliaires afin de poser un diagnostic 2/8
3 Macrophages alvéolaires pouvant être plus ou moins chargés en matériel. On peut caractériser les surcharges des macrophages selon leur contenu. Si surcharge en fer = sidérophages. Leur présence est témoin d une hémorragie alvéolaire. Pour affirmer la présence d'hémorragie alvéolaire il faut qu au moins 20 à 30 % des macrophages soient surchargés en fer. On utilise la coloration de Perls pour mettre le fer en évidence (coloré en bleu). Le Perls colore le fer ferrique Fe 3+ et ne met donc pas en évidence le fer ferreux des hématies (Fe 2+). Si surcharge en lipides = lipophages. C est le témoin d un reflux gastro-oesophagien ou d un trouble de la déglutition. On utilise la coloration de Papanicolaou ou de Oil Red. En coloration de Papanicolaou, on observe des petites vacuoles vides dans le cytoplasme. En coloration de OIL RED, les vacuoles de lipides sont colorées en rouge. Cellules oropharyngées : on les retrouve dans l oropharynx et elles ne sont pas censées être dans les bronches. Contamination fréquente des prélèvements brocho-pulmonaires lors du passage de l endoscope par le pharynx. Lymphocytes/hématies : PNN, PNE, Ly et GR. 3/8
4 III. Pathologie pulmonaire : phagocytose de particules minérales non hydrolysables Les macrophages alvéolaires sont capables de détruire les particules biologiques mais pas minérales. Dans le cas des particules minérales, les enzymes lysosomales ne sont pas capables de les détruire, il y a donc rupture de la membrane du lysosome avec libération des enzymes lysosomales dans le cytoplasme du macrophage ce qui le détruit. La particule n ayant pas été détruite elle va être prise en charge par un autre macrophage ce qui cause un cercle vicieux avec une destruction des macrophages alvéolaires et persistance de la particule minérale. Cela cause une inflammation et une destruction des alvéoles. (CR : cette inflammation est est consécutive à la libération des molécules pro-inflammatoires lors de la destruction de macrophage). Après inhalation de fibres d amiante, les patients sont exposés a plus ou moins long terme à l'insuffisance respiratoire chronique ; puis plusieurs décennies plus tard, ils sont exposé à des risque de cancer du poumon ou de la plèvre (mésothéliome). L exposition à l amiante peut être du à une exposition professionnelle (maladie professionnelle = asbestose) car l amiante était utilisé comme isolant thermique dans la construction et dans l industrie, elle est aujourd hui interdite en France depuis L exposition peut aussi être naturelle car il existe des gisements naturels d amiante (canada ou corse). 4/8
5 IV. Pathologie pulmonaire cancéreuse : diagnostic cytologique du cancer du poumon. Ex : épanchement pleural malin. Quel volume maximum peut-on ponctionner lors d un épanchement pleural? On peut avoir un épanchement pleural supérieur à 3L chez certains patients. Il peut y avoir différents aspects : Hémorragique = riche en hématies Citrin Lactescent (CR : en cas de chylothorax) Quelles cellules peut-on retrouver dans le liquide pleural? Tous les leucocytes (lymphocytes, macrophages, PNN, PNE, PNB), des hématies et les cellules mésothéliales (cellules épithéliales de la plèvre). Dans certains cas on peut retrouver des cellules cancéreuses. Exemples : - Tumeurs primitives de la plèvre : mésothéliome pleural malin (exposition à l amiante +++) - Métastases pleurales par un carcinome épidermoïde (malpighien kératinisé) - Métastases pleurales par un carcinome neuroendocrine à petites cellules - Métastases pleurale par un adénocarcinome (regroupement en amas compact) Parfois on complète l analyse cytologique par une analyse immunocytochimique pour confirmer le diagnostic mais aussi pour déterminer l origine de la tumeur (cytokératine = épithélial, vimentine = marqueur des cellules d'origine mésoblastique). Maintenant, on ne se contente plus des analyses cytologiques standards, on fait des examens complémentaires pour compléter le diagnostic : on recherche le statut mutationnel de la tumeur par biologie moléculaire (FISH) pour savoir si le patient est éligible à une thérapie ciblée. 5/8
6 B. Notions de biologie cellulaire et moléculaires. Les récepteurs à activité tyrosine kinase I. Structure C est une protéine transmembranaire avec un seul domaine TM. Le site de liaison du ligand est extracellulaire et le domaine d activité tyrosine kinase est cytosolique. Les ligands sont les facteurs de croissance (EGF, VEGF ) et l insuline. II. Activation C est la liaison du ligand au niveau du domaine extracellulaire qui va entraîner la dimérisation des récepteurs (homo ou hétéro dimères). La dimérisation entraîne leur activation avec auto-phosphorylation au niveau des résidus tyrosine. Il y a ensuite recrutement des protéines associées qui sont phosphorylées à leur tour avec le début de la transmission du signal. III. Cascade de signalisation Ex : activation de la protéine G monomérique Ras. Il y a recrutement de la protéine Ras GEF qui permet l échange entre le GDP et le GTP de la protéine G monomérique Ras (liée à l état inactif au GDP). Cet échange se fait grâce au Ras GEF recruté par une protéine intermédiaire. Il y a changement de conformation de Ras qui devient Ras activé et active à son tour une kinase en la phosphorylant. Cette kinase en phosphoryle une autre etc c est la cascade de signalisation. 6/8
7 La phosphorylation de protéines va réguler les voies intervenant dans la différenciation, la survie cellulaire et la prolifération. C est ces voies qui sont dérégulées dans le cancer. IV. RTK et cancer Ex : Sur-activation des voies de signalisation des RTK : Étude par FISH ou par biologie moléculaire pour savoir si le patient est éligible pour une thérapie ciblée : Excès de ligand sécrété par les cellules cancéreuses. Tous les récepteurs sont activés en permanence -> trop forte activité -> trop forte signalisation. Thérapie = Ac monoclonal qui bloque les récepteurs (Cetuximab qui bloque le récepteur à l EGF). Mutation du domaine kinase auto activation permanente du récepteur sans qu il y ait besoin du ligand. Thérapie = inhibiteur de la tyrosine kinase (géfitinib) Rq : tous les inhibiteurs de tyrosine kinase finissent par «inib». 7/8
8 Ex : Traitement du cancer du poumon par inhibiteurs tyrosine kinase : On observe les résultats d'un scanner avec deux masses pulmonaires Il faut réaliser un prélèvement à visée diagnostic cyto/histologique de la tumeur. Une fois le diagnostic fait, si on est dans le cas d un adénocarcinome on va identifier la carte d identité de la tumeur : recherche de mutations, des gènes EGFR, ALK Carte d identité moléculaire : Analyse moléculaire = séquençage du gène EGFR. Mutation activatrice du domaine tyrosine kinase de l EGFR Activation permanente du domaine Prolifération cancéreuse augmentée Ex : Recherche de réarrangement du gène ALK par FISH : Fusion avec un autre gène Hyper-expression de ALK et protéine de fusion EML4-ALK Homodimérisation Phosphorylation constitutive du domaine kinase Activation des voies PI3K/Akt et Ras/MAPK Thérapie ciblée citozinib (seulement s il y a réarrangement spécifique d un gène (EGFR, ALK )). Le patient est éligible à une thérapie ciblée si on met en évidence une mutation spécifique dans un gène (EGFR, ALK ). Conclusion : A partir d un liquide pleural, on peut réaliser une analyse cytologique la cytologie conventionelle, compléter ou non par une immunocytochimie et faire aussi de la biologie moléculaire et de la FISH. Il faut donc avoir assez de prélèvements. Il faut envoyer le maximum de prélèvement au laboratoire. 8/8
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