"MARQUEURS MOLÉCULAIRES EN ÉCOLOGIE & ÉVOLUTION"

Transcription

1 Master BGAE M1 - Evolution Génomique & Paléobiologique TRAVAUX PRATIQUES "MM2E" "MARQUEURS MOLÉCULAIRES EN ÉCOLOGIE & ÉVOLUTION" Emmanuel DOUZERY Catherine MOULIA Fabienne JUSTY

2 EVALUATION L'intégralité de ces 2 journées de TP pourra faire l'objet d'une ou plusieurs questions lors de l'écrit final.

3 OBJECTIFS du TP 1. Manipuler le matériel et les produits chimiques classiques d'un laboratoire de biologie moléculaire ;

4 LES PIPETMANS Cônes jaunes Cônes bleus Cônes à filtre

5 LES PIPETMANS

6 LES TUBES EPPENDORFS 1,5 ml PCR (0,5 ml) 2 ml 1,5 ml

7 LES CENTRIFUGEUSES Equilibrer les tubes dans le rotor!

8 LES POUBELLES - Poubelles de paillasse : tubes, cônes - Poubelle protégée : en métal, avec ouverture étroite A utiliser pour les cônes avec produit dangereux - Poubelle biologique & chimique (en carton) : vous y jetez le contenu des poubelles de paillasse à la fin du TP - Poubelle courante : papiers, plastiques

9 OBJECTIFS du TP 1. Manipuler le matériel et les produits chimiques classiques d'un laboratoire de biologie moléculaire ; 2. Appliquer des techniques de biologie moléculaire pour : - identifier et typer des espèces biologiques ; - appréhender la structure de leur génome. Comprendre les forces (avantages) et les faiblesses (inconvénients et limites) de ces approches.

10 A. LE MODÈLE D'ÉTUDE POUR LE TYPAGE MOLÉCULAIRE Classe : MAMMIFÈRES Ordre : CETARTIODACTYLES "Ongulés à nombre pair de doigts" Sous-ordre : RUMINANTS

11

12 Identification / Distinction de 3 espèces de ruminants : Addax nasomaculatus Giraffa camelopardalis Moschus moschiferus. Utilisation d'un marqueur ADN mitochondrial

13 B. LE MARQUEUR MOLÉCULAIRE : L'ADN MITOCHONDRIAL - Plusieurs mitochondries par cellule ; - Plusieurs ADNmt par mitochondrie.

14 1 2 S F O H T C Y B V P 1 6 S L Région de contrôle E N D 6 L H N D 5 N D 1 I Q pb H, S, L M N D 2 A, N, C, Y W S O L N D 4 N D 4 L R G N D 3 C O III C O I D K A T P a s e s 6, 8 C O II L ADN mitochondrial des Mammifères Placentaires 13 gènes protéiques 2 gènes d'arn ribosomique 22 gènes d'arn de transfert 1 région non codante

15 C. APPROCHE DE LA STRUCTURE DU GÉNOME : LE CAS DE LA SOURIS

16 D. COMMENTAIRE D'ARTICLE SCIENTIFIQUE

17 1. EXTRACTION D'ADN TOTAL DE SOURIS [Topo : milieu Matinée N 1] 2. AMPLIFICATION SPÉCIFIQUE PAR PCR D'UN MARQUEUR ADN DIAGNOSTIQUE [Topo : début Après-midi N 1] 3. MISE EN ÉVIDENCE DU POLYMORPHISME NUCLÉOTIDIQUE PAR RFLP (Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction) [Topo : début Matinée N 2] 4. ANALYSE DES RÉSULTATS ET SYNTHÈSE [Topo : dernière 1/2 journée]

18

19 1. EXTRACTION D'ADN TOTAL - Le principe du protocole 2. AMPLIFICATION SPÉCIFIQUE PAR PCR D'UN MARQUEUR ADN DIAGNOSTIQUE 3. MISE EN ÉVIDENCE DU POLYMORPHISME NUCLÉOTIDIQUE PAR RFLP (Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction) 4. ANALYSE DES RÉSULTATS ET SYNTHÈSE

20 EUCARYOTES ADN nucléaire ADN mitochondrial Cellule à noyau

21 Lyse de la membrane plasmique et du réseau membranaire interne

22 Lyse des doubles membranes nucléaires et mitochondriales

23 Seule la PCR peut permettre de retrouver l'aiguille (= la séquence d'intérêt) dans la botte de foin (= l'adn total)!

24 Le danger de l'extraction d'adn : l'attaque des acides nucléiques par les nucléases!

25 1. EXTRACTION D'ADN TOTAL - Le principe du protocole - La vérification de la présence d'adn sur gel d'agarose 2. AMPLIFICATION SPÉCIFIQUE PAR PCR D'UN MARQUEUR ADN DIAGNOSTIQUE 3. MISE EN ÉVIDENCE DU POLYMORPHISME NUCLÉOTIDIQUE PAR RFLP (Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction) 4. ANALYSE DES RÉSULTATS ET SYNTHÈSE

26 Confection d'un gel d'agarose. Il va permettre de séparer les fragments d'adn sur la base de leur taille respective. Utilisation d'un marqueur de taille qui va permettre d'évaluer la taille des bandes (fragments d'adn)! Attention : le fluorochrome (BET) est dangereux! Il faut porter des gants

27 Moule à gel et peigne pour les puits 2. Le montage du gel 3. Le chargement du gel 4. La révélation aux UV

28

29 1. EXTRACTION D'ADN TOTAL 2. AMPLIFICATION SPÉCIFIQUE PAR PCR D'UN MARQUEUR ADN DIAGNOSTIQUE (Présentation : après-midi N 1) 3. MISE EN ÉVIDENCE DU POLYMORPHISME NUCLÉOTIDIQUE PAR RFLP (Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction) 4. ANALYSE DES RÉSULTATS ET SYNTHÈSE

30 LE PRINCIPE DE LA PCR 5' Séquence cible 3' 5' 3' Amorce directe Amorce réverse 5' 3' Nucléotides 5' (dntp) pour la néosynthèse d'adn3' 3' Taq polymérase (enzyme thermostable) Tampon de l'enzyme Mg 2+ (sous forme de MgCl 2 ) 5'

31 CYCLE N 1 5' Séquence cible 3' 5' Dénaturation à 95 C 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5'

32 CYCLE N 1 5' Séquence cible 3' 5' Dénaturation à 95 C 3' Hybridation à ~ 50 C 5' 3' 5' 3' 3' 5'

33 CYCLE N 1 5' Séquence cible 3' 5' Dénaturation à 95 C 3' Hybridation à ~ 50 C 5' 3' 5' Elongation à ~ 70 C 3' 3' 5'

34 CYCLE N 2 Brin initial Brin néosynthétisé au cycle N 1, mais de trop grande taille 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 5' 3'

35 CYCLE N 2 Brin initial Brin néosynthétisé au cycle N 1, mais de trop grande taille 5' 3' 3' 5' 5' 3' { 3' 5' } 3' 5' 5' 3' Brin néosynthétisé au cycle N 2, mais toujours trop long Brin néosynthétisé au cycle N 2, de la bonne taille

36 CYCLE N 3 Brin initial 5' 3' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 5' 5' 3' 3' 5' { } 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' ADN double brin néosynthétisé de la bonne taille

37 CYCLE N 4 Matrice = 1 molécule au départ Bilan [ ] x3 [ ] [ ] [ ] x3 x3 x4 Amplifiat trop long = 4 molécules Amplifiat cible = 11 molécules LA PCR : UNE AMPLIFICATION SPÉCIFIQUE D ADN

38

39 Amplification par PCR d'un fragment de 3 kb Q F CR T 1 2 S C Y B P S3 L pb comprenant de l'adn codant (ribosomique, protéique) et de l'adn non codant. L ADN mitochondrial des Mammifères 13 gènes protéiques 2 gènes d'arn ribosomique 22 gènes d'arn de transfert 1 région non codante

40 LES AMORCES Amorce directe [Forward] L1 : 5' CGAGATCTGAAAAACCATCGTTG 3' (position N dans le génome mitochondrial complet de l'éléphant, Loxodonta africana) Amorce réverse [Reverse] S3 : 5' CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTT 3' (position N 486 dans le génome mitochondrial complet du rat, Rattus norvegicus)

41

42 5' A C C Ajout posttranscriptionnel 3' Tige Accepteur Boucle D * Tige Dihydro- Uridine Tige AntiCodon Tige TψC * Boucle variable * Boucle TψC X Y Z Boucle AC Anticodon La structure des ARNt est conservée!

43 AFLP : RECHERCHE DE POLYMORPHISME MOLÉCULAIRE PAR UNE TECHNIQUE DÉRIVÉE DE LA PCR Amplified Fragment Length Polymorphism

44 Une combinaison de différentes bandes caractérise chaque échantillon.

45 Sophistication des AFLP par utilisation de fluorochromes.

46 Les AFLP permettent de reconstruire les relations de parenté entre souches bactériennes.

47 1. EXTRACTION D'ADN TOTAL 2. AMPLIFICATION SPÉCIFIQUE PAR PCR D'UN MARQUEUR ADN DIAGNOSTIQUE 3. MISE EN ÉVIDENCE DU POLYMORPHISME NUCLÉOTIDIQUE PAR RFLP (Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction) [1/2 journée N 3] - Les enzymes de restriction 4. ANALYSE DES RÉSULTATS ET SYNTHÈSE

48

49 UTILISATION D'UNE ENZYME DE RESTRICTION C'est une paire de ciseaux moléculaire qui va découper la double hélice d'adn (= les 2 brins) au niveau de sites particuliers : les sites de restriction.

50 Si les 12 nucléotides (= 6 paires de bases) du site BamHI sont simultanément respectés, alors l'enzyme de restriction BamHI COUPERA la double hélice d'adn. 5' - G G A T C C - 3' 3' - C C T A G G - 5' G A T C C - 3' 5' - G G - 5' 3' - C C T A G

51 Si les 12 nucléotides (= 6 paires de bases) du site BamHI ne sont pas simultanément respectés, alors l'enzyme de restriction BamHI NE COUPERA PAS. 5' - G G A T C C - 3' 3' - C C T A G G - 5' 5' - G G A A C C - 3' 3' - C C T T G G - 5' X Des différences de profils de restriction peuvent donc révéler l'existence de mutations apparues au cours de l'évolution des espèces.

52

53 Enzyme de restriction Bgl II

54 BamHI ADN

55 DIGESTION D'ADN GÉNOMIQUE DE SOURIS Quels sont les facteur susceptibles d'avoir un impact sur la taille des fragments obtenus?

56 1. EXTRACTION D'ADN TOTAL 2. AMPLIFICATION SPÉCIFIQUE PAR PCR D'UN MARQUEUR ADN DIAGNOSTIQUE 3. MISE EN ÉVIDENCE DU POLYMORPHISME NUCLÉOTIDIQUE PAR RFLP (Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction) - Les enzymes de restriction - Révélation du polymorphisme : le gel d'agarose 4. ANALYSE DES RÉSULTATS ET SYNTHÈSE

57 Taille (pb) Distance de migration (mm)

58

59 1. EXTRACTION D'ADN TOTAL 2. AMPLIFICATION SPÉCIFIQUE PAR PCR D'UN MARQUEUR ADN DIAGNOSTIQUE 3. MISE EN ÉVIDENCE DU POLYMORPHISME NUCLÉOTIDIQUE PAR RFLP (Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction) 4. ANALYSE DES RÉSULTATS ET SYNTHÈSE - RFLP sur l'adn mitochondrial de Ruminants

60 AVANTAGES DE LA PCR 1. Amplification de traces de l ADN cible : - économies de matériel biologique ; - travail sur des espèces rares ou difficilement accessibles. 2. Rapidité de l amplification. 3. Spécificité de l amplification.

61 INCONVÉNIENTS DE LA PCR 1. Le problème de la contamination par des ADN étrangers : ex. : ADN "Addax" contaminé par ADN "Moschus" ; 2. Le problème de l identification des copies amplifiées : - le cas des séquences cibles présentes en plusieurs exemplaires similaires : ex. : globine α et globine β ; - le cas du mélange de plusieurs copies différentes : ex. : gène X et gène Y.

62 Digestion Apa I Digestion Asn I Digestion Bam HI AN GC MOS AN GC MOS AN GC MOS Marqueur λ EcoRI + HindIII 5,0 kb 2,0 kb 1,0 kb 0,5 kb

63 Digestion Apa I Digestion Asn I Digestion Bam HI AN GC MOS AN GC MOS AN GC MOS Marqueur λ Eco RI + Hind III 35, ,5 48,5 38, , ,5 54,6 56, ,9 60,3 59,3 66,3 81/106/122/122 36,5 47,5 38, ,5 49, [5148 pb] 33 [2027 pb] 38 [1584 pb] 41 [1375 pb] 50 [947 pb] 54 [831 pb] 63 [564 pb]

64 Digestion Apa I Digestion Asn I Digestion Bam HI AN GC MOS AN GC MOS AN GC MOS Marqueur λ Eco RI + Hind III 1998 pb /58/26/ Σ

65

66 1. EXTRACTION D'ADN TOTAL 2. AMPLIFICATION SPÉCIFIQUE PAR PCR D'UN MARQUEUR ADN DIAGNOSTIQUE 3. MISE EN ÉVIDENCE DU POLYMORPHISME NUCLÉOTIDIQUE PAR RFLP (Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction) 4. ANALYSE DES RÉSULTATS ET SYNTHÈSE - RFLP sur l'adn mitochondrial de Ruminants - RFLP sur l'adn génomique de souris

67 HpaII : 5' C C G G 3' RsaI : 5' G T A C 3' 3' G G C C 5' 3' C A T G 5' Asn I : 5' A T T A A T 3' ApaI : 5' G G G C C C 3' Bam HI : 5' G G A T C C 3' DraI : 5' T T T A A A 3' 3' T A A T T A 5' 3' C C C G G G 5' 3' C C T A G G 5' 3' A A A T T T 5'

68 } Ilôt CpG } Ilôt CpG

69

70 COMMENTAIRE D'ARTICLE SCIENTIFIQUE

71 Didelphis marsupialis Didelphis albiventris MARSUPIALIA DIDELPHIDAE

72 Didelphis marsupialis

73 D I D E LP H ID A E MP / ML / Bay 0.1 s. p. s. * 86/96/1.00 * * * 99/100/1.00 * * * 91/99/ /68/ /86/1.00 * * * Macropus giganteus Caluromys philander Thylamys sp. * * * Caenolestes fuliginosus Marmosops noctivagus Marmosops impavidus Marmosops parvidens Marmosops pinheiroi Gracilinanus microtarsus Metachirus nudicaudatus Chironectes minimus Lutreolina crassicaudata Philander opossum Philander mcilhennyi Didelphis albiventris Didelphis marsupialis Monodelphis brevicaudata Marmosa mexicana Micoureus demerarae Marmosa lepida Marmosa murina 4,5 kb cyb + 12S TTR + IRBP [Steiner et al 2005 MPE]

74 Définition d'oligonucléotides diagnostiques

75 Sonde marsupialis X X X X X X X X X X X X Sonde albiventris

76