Exercice 1. KinA. Spo0F Sda. KinA. Spo0F

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1 Exercice 1 La protéine Sda (46 acides aminés) inhibe le phosphorelais en réponse aux dommages à l ADN. Afin de déterminer le mode d action de Sda, plusieurs expériences sont réalisées. 1. La protéine KinA (606 acides aminés) purifiée (10 pmoles) est incubée en présence d ATP radioactif et de différentes concentrations de Sda également purifiée. Après 10 minutes d incubation, les échantillons sont déposés sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante et révélés par autoradiographie. KinA Expliquez l expérience réalisée et analysez les résultats obtenus. 2. Après incubation en présence d ATP radioactif, la protéine KinA est purifiée. Elle est ensuite mélangée avec la protéine Sda purifiée puis la protéine Spo0F purifiée est ajoutée. Après 10 minutes d incubation, les échantillons sont déposés sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante et révélés par autoradiographie. Spo0F Sda KinA Spo0F Expliquez l expérience réalisée et analysez les résultats obtenus.

2 3. La protéine KinA est composée deux domaines : un domaine de détection (1 à 382) et un domaine autokinase (383 à 606) séparé en deux sous-domaines, le domaine catalytique de fixation de l ATP (456 à 606) et le domaine DHp (dimérisation et phosphotransfert) contenant le site d autophosphorylation (383 à 455). Deux formes tronquées de KinA ont été produites, purifiées et fixées sur des billes. Les billes sont ensuite incubées en présence de Sda pendant 1h. Les billes sont ensuite récoltées par centrifugation et des échantillons correspondant au surnageant (S) et au culot de billes (B) sont déposés sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante et révélés par coloration au bleu de coomassie. Billes seules Billes + KinA Billes + KinA S B S B S B KinA KinA Sda Expliquez l expérience réalisée et analysez les résultats obtenus. En vous appuyant sur vos connaissances et sur les résultats présentés, proposez un modèle dans lequel le rôle de Sda dans le phosphorelais est clairement indiqué.

3 Exercice 2 Les expériences suivantes ont été réalisées afin de mieux comprendre le mécanisme d activation du facteur sigma K. Pro- K : 241 acides aminés K : 221 acides aminés Différentes protéines de fusion ont été construites entre pro- K et la GFP (green fluorescent protein) : a. pro- K -GFP (totalité de pro- K fusionnée à la GFP) b. pro- K (1-27)-GFP (acides aminés 1 à 27 de pro- K fusionnés à la GFP) c. pro- K (1-109)-GFP (acides aminés 1 à 109 de pro- K fusionnés à la GFP) d. pro- K (1-117)-GFP (acides aminés 1 à 117 de pro- K fusionnés à la GFP) e. pro- K (1-126)-GFP (acides aminés 1 à 126 de pro- K fusionnés à la GFP) f. proless- K (1-[ 2-20]-27)-GFP (même construction que pro- K (1-27)-GFP mais délétée des résidus 2 à 20 de pro- K ) g. proless- K (1-[ 2-20]-109)-GFP (même construction que pro- K (1-109)-GFP mais délétée des résidus 2 à 20 de pro- K ) Ces constructions ont été introduites par recombinaison dans le chromosome d une souche sauvage de Bacillus subtilis ainsi que dans une souche spoivfb. La croissance des deux souches dans un milieu adéquat pour la sporulation est suivie au cours du temps. 1. Des prélèvements sont réalisés 3h, 4h, 5h et 6h après le début de la sporulation. Les échantillons sont analysés par Western Blot en utilisant un anticorps anti-gfp. Analyser les résultats. Souche : sauvage spoivfb Temps (h) :

4 2. Les échantillons de la souche spoivfb, prélevés 4 heures après le début de la sporulation, sont traités de façon à séparer la fraction cytoplasmique (C) de la fraction membranaire (M) puis sont analysés par Western Blot en utilisant un anticorps anti-gfp. Analyser les résultats. pro- K -GFP S : surnageant (C+M) 3. Quelles conclusions pouvez vous tirer de ces deux expériences. Quel modèle pouvez vous proposer pour l activation du facteur sigma K?

5 Exercice 3 Un gène dont le produit est homologue à la protéine RapA a été identifié sur le chromosome de Bacillus subtilis et a été appelé rape. Un petit cadre ouvert de lecture, appelé phre, est situé en aval du gène rape et chevauche ce dernier de quelques nucléotides. Afin d étudier le rôle de RapE et de PhrE, plusieurs expériences ont été réalisées. Analyser les résultats obtenus pour chaque expérience. Que pouvez vous proposer comme rôle pour RapE et PhrE? Proposer un modèle. 1. L efficacité de sporulation a été mesurée dans différentes souches de Bacillus subtilis (sauvage et mutantes). Phénotype des souches % sporulation WT 58,7 PhrE - 22,9 RapE - PhrE - 68,2 RapE - 65,2 Spo0F (Y13S) 86,6 Spo0F (Y13S) PhrE - 83,3 Spo0F (Y13S) : forme mutée de Spo0F qui est insensible à l action de RapA 2. A. La protéine Spo0F purifiée est incubée en présence de KinA et d ATP radioactif pendant 30 minutes. Un échantillon est prélevé (temps 0) avant de rajouter la protéine RapE purifiée. Des échantillons sont ensuite prélevés à différents temps. Tous les échantillons sont déposés sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante et révélés par autoradiographie. B. Les protéines Spo0A phosphorylée (pistes 1 et 2) et Spo0B phosphorylée (piste 3 et 4) sont incubées pendant 30 minutes en présence (pistes 2 et 4) ou en absence de RapE (pistes 1 et 3).

6 3. La même expérience que celle décrite dans la partie 2A est réalisée sauf que RapE est préincubée en présence de PhrE (A) ou de PhrA (B) avant d être ajoutée au mélange contenant Spo0F, KinA et l ATP radioactif. PhrE PhrA Piste 1 : contrôle (pas de RapE) Piste 2 à 6 : quantité croissante de PhrE ou de PhrA