DESC d Allergologie et d Immunologie Clinique Lorna GARNIER Laboratoire d Immunologie Pr. BIENVENU, CHLS

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1 DESC d Allergologie et d Immunologie Clinique Lorna GARNIER Laboratoire d Immunologie Pr. BIENVENU, CHLS 1

2 CLASSIFICATION DE GELL ET COOMBS

3 EXPLORATION DE L HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV Les tests QUANTIFERON et TSPOT TB dans l aide au diagnostic de la tuberculose 3

4 Parmi les principales causes de mortalité infectieuse dans le monde 1 contamination / seconde 1 décès / 17 secondes Objectif O.M.S.: la prévalence et la mortalité de la tuberculose de moitié en 2015 / 1990 Éliminer la tuberculose en 2050 (cad < 1 nouveau cas / million d habitants/an) Kaufmann SHE. Immunity,

5 Infection abortive Infection primaire 5% des cas Tuberculose latente 95% des cas Persistance de la bactérie sous forme quiescente 5 Kaufmann SHE, Nature Review Immunology 2001

6 Inhalation de gouttelettes contenant quelques bacilles Au niveau alvéolaire : Réponse immunitaire innée Phagocytose par macrophage Résistance à la lyse phagolysosomale Migration cellulaire jusqu aux ganglions lymphatiques 6

7 Immunité antituberculeuse protectrice : type Th1 Antigènes de M. tuberculosis présentés par les cellules dendritiques aux Ly T naïfs Différenciation des Ly en Ly Th1 sous l influence de l Interleukine 12 Kaufmann SHE. Immunity,

8 8

9 Les cellules mémoires et effectrices circulent dans le sang Cellules mémoires Kaufmann SHE. Immunity,

10 Pas de symptômes Pas de contagion Réponse immunitaire détectable 10

11 Test cutané : Intradermoreaction à la tuberculine Tests de détection de l IFNγ (IGRAs Interferongammarelease Assays) Measurement of induration and erythema Measurement of IFNγ production 11

12 Source antigénique : > 200 protéines de M.tuberculosis Lecture à 72h par mesure du diamètre d induration en mm Seuil de positivité 12

13 Performance et de logistique : Subjectivité Sensibilité moyenne Effet Booster Nécessité de 2 visites Faible spécificité : Réaction croisée avec le BCG Mycobactéries non tuberculeuses (NTM) 13

14 Détection in vitro de la production d IFNɤ par les lymphocytes T spécifiques de M.tuberculosis après stimulation avec des protéines mycobactériennes Test ELISA QuantiFERONTB Gold Test ELISPOT TSPOT TB IFNɤ : Rôle central dans l immunité antituberculeuse Sécrété par les lymphocytes T après stimulation Mesurable et Stable 14

15 Antigènes spécifiques ESAT6 CFP10 TB 7.7 Codage par les gènes de la région RD1 Antigènes spécifiques du BCG Antigènes spécifiques de M. tuberculosis Absents de la plupart des mycobactéries atypiques Induisent la sécrétion d IFNɤ Antigènes communs ESAT6 : Early Secretory Antigen 6 CFP10 : Culture Filtrate Protein 10 complex 15

16 Complex Tuberculosis ESAT CFP TB7.7 Mycobactéries non TB ESAT CFP M abcessus M avium M branderi M celatum M chelonae M fortuitum M gordonii M intracellulare M kansasii + + M malmoense M marinum + + M oenavense M scrofulaceum M smegmatis M szulgai + + M terrae M vaccae M xenopi TB7.7 M tuberculosis M africanum M bovis Souches BCG gothenburg moreau tice tokyo danish glaxo montreal pasteur

17 Avantages des tests IGRA Pas de seconde visite Peu d effet booster Reproductibilité des tests et réactifs Résultat objectif Spécificité +++ (BCG, Mb atypiques) Contrôle + : mise en évidence des faux négatifs 17

18 Test ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) Dosage sur sang total (anticoagulant : héparine) Incubation des cellules mononucléées du sang périphérique avec les protéines mycobactériennes Dosage de l IFNγ plasmatique par technique ELISA (UI/mL) Contrôle ESAT6 CFP10 Mitogene Contrôle + incubation à 37ºC pdt 1624h 2. Centrifugation 3. Plasma +conjugué Incubation 2H. 4. Lecture spectrophotométrique 18

19 Témoin négatif Témoin positif Stockage des tubes à température ambiante Prélèvement : 3 x 1 ml Agitation douce par retournements (x5) Incubation à 37 C 16 à 24h le plus rapidement possible 19

20 Preanalytical delay reduces sensitivity of QuantiFERONTB Gold InTube for detection of latent tuberculosis infection Doberne et al. Journal Clin. Microb. 2011;49(8): Négativation des QFT 19% (5/26) à 6h 22% (5/23) à 12h 20

21 Nul Témoin Tube gris TB Ag Nul Tube patient Tube rouge Mit Nul Témoin + Tube violet Résultat 8 < NEGATIF POSITIF ININTERPRETABLE Abs ctrl positif 8 ININTERPRETABLE Activation spontanée 21

22 Antigènes spécifiques (testés séparément) : ESAT CFP10 A partir de Cellules mononucléées Technique ELISPOT 22

23 Prélèvement de sang dans un tube Vacutainer CPT centrifugation du tube Prélèvement des cellules mononucléées Lavage et comptage cellulaire (cellule ou automate d hématologie) Ajout des cellules aux plaques 96 pts Ajout des antigènes dans les puits (ESAT6, CFP10) Incubation 16 à 24h 23

24 PBMC après extraction Ficoll ou tubes BD CPT Ajout des PBMC et Ags TB. Les Ly T spé sécrètent l IFNγ. Capture de l IFNγ par les anticorps. Incubation. Chaque spot correspond à une cellule sécrétrice d IFNɤ Lavages et ajout de l Ac conjugué Ajout du substrat Apparition des spots en 7 minutes 24

25 Comptage du nombre de spot à l oeil à l aide d une loupe binoculaire ou d un microscope Comptage à l aide d un lecteur automatisé Elispot : Lecture automatisée des plaques Calcul du nombre de spots par puits Stockage des images sur PC Paramétrage automatique de la caméra et de l analyse Validation : nb de spots panel A/B Témoin négatif 8 : POSITIF 4 : NEGATIF 5 et 7 : DOUTEUX 25

26 Témoin négatif Témoin positif Panel A Panel B 26

27 TEST POSITIF fréquence élevée de Ly T (effecteurs/mémoires) spécifiques de M. tuberculosis : rencontre de M. tuberculosis faux positifs rares (M. kansasii, M. marinum, M.szulgai <200 cas / an en France) Risque de réactivation M. tuberculosis si immunodépression (infection VIH, tt antitnf)! Les IGRA ne permettent pas de distinguer l infection tuberculeuse latente de la tuberculose maladie 27

28 Test NEGATIF Ne permet pas d exclure une infection par M. tuberculosis Test ININTERPRETABLE Absence d activation dans le contrôle positif Indication sur la compétence immunitaire du patient (âge, déficit ) Validation de la conservation des prélèvements avant incubation et de la manipulation. Activation spontanée dans le contrôle négatif : Infection, inflammation 28

29 EvidenceBased Comparison of Commercial Interferongamma Assays for Detecting Active TB : A Metaanalysis R. Diel, R. Loddenkemper and A. Nienhaus Chest 2010;137; Etudes analysées : 676 citations 124 études retenues (exclusions : edito, medicoeconomique, revues, lettres, case report, données insuffisantes ) Sensibilité : 40 études Spécificité : 7 études R. Indéterminés : 116 études 29

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32 Patients immunodéprimés 32

33 Meilleure performance diagnostique des IGRAs par rapport à l IDR (supériorité des IGRAs dans les pays développés) Sensibilité : TSPOT TB > QFT TB Gold IT Spécificité : QFT TB Gold IT > TSPOT TB Résultats indéterminés : TSPOT TB > QFT TB Gold IT IDR avant IGRAs non recommandée 33

34 Diagnostic de tuberculoseinfection latente pour réaliser l enquête autour d un cas (sujet > 15 ans) Lors de l embauche, pour les professionnels de santé et ceux qui travaillent dans un service à risque, c estàdire dans les mêmes conditions que celles préconisées par les recommandations sur l IDR Aide au diagnostic des formes extra pulmonaires de la tuberculose maladie Avant mise en route d un traitement par antitnfα 34

35 Utilisation stricte des tests IGRA dans le seul diagnostic de l ITL et uniquement dans l objectif de la traiter (sauf cas particulier) Diagnostic de ITL : le réservoir de patients infectés Enquête autour d un cas : prise en charge des sujets contacts (enfants > 5 ans sujets âgé > 80 ans) Patients infectés par le VIH (bilan initial) Dépistage avant mise sous antitnf Personnel de santé (y compris stagiaires et étudiants) : embauche (si IDR > 5 mm) cas contact Migrants entre 5 et 15 ans Diagnostic de tuberculose maladie : Chez l enfant (ITL : Infection tuberculeuse latente) 35

36 Matulis et al. American College of Rheumatology, San Diego, CA. November 2005 Comparison of in vitrospecific blood tests with tuberculin skin test for diagnosis of latent tuberculosis before antitnf therapy Sellam J. et al. Ann. Rheum Dis. 2007;66(12):16105 Detection of latent tuberculosis in immunosuppressed patients with autoimmune diseases: performance of a Mycobacterium tuberculosis antigenspecific interferon gamma assay Matulis G. et al. Ann Rheum Dis. 2008;67(1):8490 Interféron gamma releasing assay versus tuberculin skin test prior to treatment with Golimumab, a human antitnf antiody, in patient with Rheumatoid Arthritis, Psoriatic Arthritis, or Ankylosing Spondylitis Hsia EC. et al. Arthritis and Rheum. 2012;64(7):

37 Influence of replacing tuberculin skin test with ex vivo interferon γ release assays on decision to administer prophylactic antituberculosis antibiotics before antitnf therapy Mariette et al. Ann Rheum Dis2012;71: Objectif : Evaluer l impact thérapeutique (% de patients pour lesquels la décision thérapeutique antitb a été modifiée par les résultats des tests in vitro par rapport aux recommandations de l AFSSAPS) du dépistage de l ITL par QFT ou TSPOTTB avant traitement par antitnfα 20 centres, 400 patients, durée 24 mois 31,8% Polyarthrite Rhumatoïde, 45% Spondylarthrite ankylosante, 23,2% Maladie de Crohn (60% immunosuppresseurs, 36,4% corticoides) 37

38 Influence of replacing tuberculin skin test with ex vivo interferon γ release assays on decision to administer prophylactic antituberculosis antibiotics before antitnf therapy Mariette et al. Ann Rheum Dis2012;71: Résultats 34,9% patients IDR > 5 mm / 16,7% patients IGRA positif 30,8% discordance IDR/IGRA (IDR+/IGRA : 80% et IDR/IGRA+ : 20%) Bonne concordance pour les deux tests IGRA Meilleure sensibilité du QFT/TSPOT TB Résultats indéterminés : 7,3% TSPOT TB et 2,8% QFT (pas d influence de la prise de corticoides ou d immunosuppresseurs) Conclusion Les tests IGRA permettent de diminuer de 50% le nombre de patients traités par antibiothérapie antituberculeuse avant biothérapie Attention : cas de TB avec IGRA négatif

39 Brock et al. Respiratory Research Risque plus élevé de developper une tuberculose maladie Forte corrélation entre le taux de CD4 et le taux de IFNγ dans le tube mitogène (P<0.01) Le nombre de TCD4, leur pourcentage et le stade de la maladie affectent les performances des tests IGRAs chez les patients HIV Log 10 Response to mitogen (IU/ml) Correlation between CD4 cell count and response to PHA >300 CD 4 cell count (cells/microliter) 39

40 Tests diagnostiques de l infection tuberculeuse latente (ITL) Excellente valeur prédictive négative dans les TB latentes Excellente spécificité / élimination des faux positifs liés au BCG préalable Intérêt dans les formes extra pulmonaires Chez les immunodéprimés, même si la sensibilité est modérée chez ce groupe de patients (ne permet pas d exclure une TB ou ITL) 40

41 Les IGRA Ne permettent pas de distinguer TB active et TB latente Ne sont pas validés chez le jeune enfant (< 5 ans) Données insuffisantes pour suivre l efficacité d un traitement pour TB active ou latente Ont une sensibilité diminuée Chez les personnes âgées Chez les immunodéprimés 41

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44 Ophtalmologie 4% Pneumologie 4% Maladies Infectieuses 11% Gyneco Obstétrique Cardiologie 1% 1% Néphrologie 1% Neurologie 1% Pédiatrie 1% Hématologie 1% Autres 4% Médecine travail 21% Médecine statutaire 12% HépatoGastro Entérologie 3% Allergologie 2% Dermatologie 5% Rhumatologie 14% Médecine Interne 15% 44