Formation Pratique en IMMUNOLOGIE

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1 Master 1 Biologie & Santé Année Formation Pratique en IMMUNOLOGIE ENCADREMENT : Madame Pascale RIALLAND-LEFEVRE Mlle Lauriane CABON Mlle Imen NAJJAR AUTEURS : PELLERIN Guillaume CHARPIE Maëlle-Charlotte CARPIER Jean-Marie

2 I. Induction de lymphocytes T cytotoxique et alloréactivité A- Principe de l alloréactivité médiée par les cellules T B- La réaction lymphocytaire mixte unidirectionnelle C- Méthodes d étude de la réaction lymphocytaire mixte D- Application de l étude de la RLM II. Etude de l induction de lymphocytes T cytotoxiques alloréactifs par RLM A- Méthode - Méthode générale de mise en place d une RLM - Méthode d acquisition et de d analyse des données B- Résultats - RLM en condition de prolifération des cellules R C- Discussion III. Méthode alternative d étude de la RLM basée sur la cytométrie en flux 2

3 Souche d haplotype H-2 a Souche d haplotype H-2 b Extraction des splénocytes LTCD4+ LT LTCD8+ Co-culture 3

4 Apoptose en fin de RLM Co-culture Activité de cytotoxicité LT LTCD8+ Prolifération LTCD4+ LTCD8+ Collaboration 4

5 Implication n 1 : Reconnaissance des CMH allogéniques par des LT alloréactifs => ALLOREACTIVITE LT LTCD8+ Interaction TCR /CMH I allogénique induit une activation du lymphocyte T CD8+ Environ 1 à 10 % de lymphocytes alloréactifs chez un individu. Raisons? Sélection thymique positive basée sur une reconnaissance faible du CMH I? Deux sortes de lymphocytes alloréactifs: Lymphocyte T alloréactif peptide-dépendant Lymphocyte T alloréactif CMH-dépendant 5

6 Implication n 2 : Dans le cadre de l étude de la RLM sur l ensemble des splénocytes, nécessité de discriminer les cellules répondeuses des cellules stimulantes Stimulation réciproque 6

7 Implication n 2 : Dans le cadre de l étude de la RLM sur l ensemble des splénocytes, nécessité de discriminer les cellules répondeuses des cellules stimulantes => Réaction lymphocytaire mixte unidirectionnelle Irradiation Drogue cytostatique Stimulation réciproque 7

8 Apoptose en fin de RLM STIMULATION ALLOGENIQUE LT LTCD8+ Activité de cytotoxicité Prolifération 8

9 Apoptose en fin de RLM STIMULATION ALLOGENIQUE 3 H-Thymidine LT LTCD8+ Activité de cytotoxicité Etude de la Prolifération Mesure de l incorporation de 3 H-Thymidine 9

10 Etude de l apotose: - Mesure de libération de Cr51 STIMULATION ALLOGENIQUE - Marquages: - Ac anti-ps - Marquage cellules cibles/cellules apoptotiques LT LTCD8+ Activité de cytotoxicité Etude de la Prolifération Mesure de l incorporation de 3 H-Thymidine 10

11 Rejet de greffe => Chez l homme, test de RLM réalisé pour définir le meilleur donneur (estimation du donneur engendrant la plus faible réponse alloréactive) BOUSSO et al., Nature Medicine. 11

12 Prélèvement de rates en conditions stériles et préparation pour ensemencement Prélèvement de rates en conditions stériles C75BL/6 (H2-b) BALB/C (H2-d) Prélèvement Rate de souris positionnée sur le flanc gauche Broyage et filtration des cellules Lyse des hématies Numération sur lame de KOVA 12

13 Co-culture des cellules Répondeuses (R)/Stimulantes (S) C75BL/6 (H2-b) R BALB/C (H2-d) S Contrôles: - PHA - Pas de cellules Traitement à la mytomycine C (agent cytostatique) 4M/mL 8M/mL 4M/mL ou 2M/mL Co-culture des cellules de rate 13

14 Co-culture des cellules de rate stimulation par des molécules HLA différentes prolifération et transformation blastique R (H2-b) (H2-d) S 3 jours Réaction unidirectionnelle Bloquée par la mitomycine Contrôle : RLM inverse S(H2-d) / R(H2-d) TEST DE CYTOTOXICITE 14

15 TEST DE CYTOTOXICITE mise en culture R(b)/S(d)avec des cellules cibles p815 (H2-d) marquées (CMFDA) à différentes concentration 1jour Apoptose des cellules cibles SI présence de L T alloréactifs Marquage au iodure de propidium Analyse par cytométrie en flux Contrôle : une condition sans cellule cible (lyse spontanée) 15

16 Méthode d acquisition et d analyse des données 1- Fenêtre sur la population CMFDA+ (cellules cibles) à partir du dot-plot IP-CMFDA 2- Détermination du pourcentage de cellules IP+ (apoptotiques/mortes) 73% 27% 16

17 Exemples de données brutes GATING 73% 27% GATING 94% 6% 17

18 Conditions testées et effets attendus condition R(b)/S(d) à 2:1, 1:1 ou 0,5:1 R(b)/S(b) à 2:1, 1:1 ou 0,5:1 R(b)/PHA R(b)/RPMI Effet attendu Stimulation proportionnelle au ratio Aucune stimulation Stimulation Aucune stimulation + contrôle sans splénocytes (cellules cibles seules) pour évaluer la lyse spontanée de ces dernières 18

19 50 Nombre de cellules IP+ parmi la population de cellules CMFDA R(b)/S(d) 2:1 R(b)/S(d) 1:1 R(b)/S(d) 0.5:1 R(b)/S(b) 2:1 R(b)/PHA R(b)/RPMI lyse spontannée 0 Rapport cellule R / cellule cible 19

20 Analyse globale / Interprétation condition R(b)/S(d) à 2:1 R(b)/S(d) à 1:1 R(b)/S(d) à 0,5:1 R(b)/S(b) à 2:1 R(b)/S(b) à 1:1 R(b)/S(b) à 0,5:1 R(b)/PHA R(b)/RPMI Cytotoxicité observée Forte (maximum) moyenne faible nulle nulle nulle nulle / quasiment nulle nulle La cytotoxicité révèle la présence de lymphocytes T CD8+ alloréactifs dans l échantillon. 20

21 L activation des cellules (qui comprend une étape prolifération) a pu être préalablement estimée au microscope inversé en regardant la confluence. Dans les plaques contrôles avec des cellules répondeuses R(d), nous n avons observé aucune cytotoxicité, quelque soit la condition. Une seule analyse de plaque est montrée donc ces résultats ne sont peut-être pas représentatifs et nous n avons pas d écart-types. Le contrôle positif (activation au PHA) n a pas bien marché? MAIS, différence entre prolifération et activation! 21

22 Difficultés de la méthode utilisée : - problème de gating des cellules CMFDA+ Délimitation de la région? > sous-estimation des débris de cellules apoptotiques - double marquage des cellules cibles : CMFDA, IP 22

23 C75BL/6 (H2-b) BALB/C (H2-d) Co-culture des cellules de rate prolifération Test de cytotoxicité 23

24 TEST DE CYTOTOXICITE mise en culture R(b)/S(d) avec des cellules cibles p815 (H2-d) marquées (CMFDA) à différentes concentration mise en culture R(b)/S(d) avec des splénocytes (H2-d et H2-b) marqués (CMFDA) Rapport 1:1 Apoptose des cellules cibles SI présence de L T alloréactifs Marquage au iodure de propidium Splénocytes H2-b : CMFDA low Splénocytes H2-d : CMFDA high Analyse par cytométrie en flux 24

25 ANALYSE EN CYTOMETRIE Splénocytes H2-b : CMFDA low Splénocytes H2-d : CMFDA high Contrôle > Nous mesurons le nombre de cellules toujours vivantes Condition allogénique Evènenements Evènenements Nbre de cellules morte par apoptose CMFDA CMFDA CMFDA - CMFDA low Splénocytes H2-b CMFDA high Splénocytes H2-d > Pas de sous estimation des débris de cellules apoptotiques 25