NOVA Gel TM Scl-70 T Uniquement pour le Diagnostic In Vitro
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- Chrystelle Laperrière
- il y a 7 ans
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1 NOVA Gel TM Scl-70 T Uniquement pour le Diagnostic In Vitro Application NOVA Gel TM Scl-70 est un système de test d immunodiffusion sur plaque pour le titrage et la détermination semi-quantitative d anticorps anti-scl-70, un antigène nucléaire soluble (ENA), dans le sérum humain. La présence d anticorps anti-scl-70 peut être utilisée conjointement avec d autres tests sérologiques et résultats cliniques afin de faciliter le diagnostic du Sclérodermie. Informations concernant le test Le terme «anticorps antinucléaires» (ANA) décrit divers autoanticorps qui réagissent avec les composants des noyaux cellulaires dont l ADN, l ARN et plusieurs protéines et ribonucléoprotéines. 1 Ces autoanticorps sont souvent présents chez des patients atteints de maladies rhumatismales ou des tissus conjonctifs ; en particulier, le SLE. Pratiquement tous les patients atteints de SLE ont une réaction positive aux ANA. Cette sensibilité du diagnostic a donné suite à l incorporation des tests de détection des ANA dans les Critères pour la Classification du lupus érythémateux disséminé lors de la modification de ceux-ci en 1982 par un sous-comité de l association de l arthrite et du rhumatisme (Arthritis and Rheumatism Association). 2 Bien que le test de détection des ANA soit un excellent test de dépistage du SLE (un résultat négatif exclut pratiquement le SLE 3 en évolution), il est loin d être un test spécifique. La tendance actuelle dans le domaine du diagnostic et de la gestion des maladies des tissus conjonctifs est de combiner un test de dépistage des ANA sensible avec des tests de suivi plus spécifiques tels que les tests anti-adn double brin et/ou ENA. Les tests ENA en particulier sont essentiels parce qu ils fournissent des données diagnostiques et pronostiques. Les anticorps anti-scl-70 sont des marqueurs spécifiques pour la sclérodermie, 2,4 de même que les anticorps anti-sm et anti-adn double brin sont des autoanticorps marqueurs spécifiques pour le SLE. L anticorps anti-scl-70 est présent chez 20 à 60 % des patients atteints de sclérodermie. 2,4,5,6 La largeur de la plage des fréquences enregistrées de l anticorps anti-scl-70 peut être due aux différences de sensibilité d analyse. 7 Lorsque les patients atteints de sclérodermie sont divisés en deux groupes dont l un comprend ceux atteints d une variante plus légère du syndrome CREST et l autre ceux atteints de sclérodermie systémique diffuse ou progressive plus grave, les résultats montrent que les anticorps anti-scl-70 sont plus répandus chez les patients atteints de sclérodermie diffuse (>70%) que chez ceux pour lesquels la maladie es Contrôles prononcée. 6,8 Principe du test L immunodiffusion sur plaque, décrite par Ouchterlony, 9 permet à une solution antigène de migrer passivement à travers une matrice de gel vers l échantillon d un patient et/ou un anticorps contenant des Contrôles. Des puits de forme spéciale creusés dans la matrice de gel servent de réservoirs à partir desquels les solutions d antigène et d anticorps migrent l une vers l autre. Au point d équivalence antigène-anticorps, un arc de précipitation visible se forme dans le gel. L état immunologique d un patient peut alors être défini en observant les motifs créés par les arcs de précipitation adjacents formés dans le gel par un échantillon Contrôle dont la spécificité est connue et un sérum de patient inconnu. La technique de double diffusion peut être utilisée avec une préparation purifiée de Scl-70, un échantillon Contrôle d autoanticorps anti-scl-70 connu et un sérum de patient censé contenir des autoanticorps anti-scl-70, afin d obtenir une identité immunologique ou une non-identité immunologique. L activité des autoanticorps anti-scl-70 dans le sérum du patient peut être confirmée si l arc de précipitation rejoint l arc formé par un échantillon Contrôle connu. Dans certains cas, une détermination semi-quantitative de la quantité d autoanticorps anti-scl-70 dans le sérum d un patient est souhaitable. Dans de tels cas, la plaque NOVA Gel «T» peut être utilisée afin d analyser un échantillon de patient dilué en série. L inverse de la plus haute dilution formant un arc de précipitation peut alors être enregistré comme le titre de l anticorps anti-scl-70 pour le patient. Une procédure d immunodiffusion sur plaques correcte nécessite l analyse de plusieurs rapports de concentration antigène-anticorps afin d éviter un excès d antigènes ou d anticorps. Un arc de précipitation incorrect ou trompeur peut se former s il y a un excès d antigènes ou d anticorps. Afin d éviter une telle situation, des analyses de dilutions du sérum du patient doivent être comparées à cette préparation d antigènes. Ceci peut être réalisé en même temps que le titrage de l échantillon du patient sur la plaque NOVA Gel «T». Contenu du coffret 1. Plaques de gel de titrage Nova Gel «T» à 7 puits, contenant des stabilisateurs et de l azide de sodium 0,09 % 2. 0,4 ml d antigène Scl-70 (du thymus de veau), lyophilisé dans une solution tampon 1
2 contenant des stabilisateurs et de l azide de sodium 0,09 % 3. 1,4 ml de Contrôle Scl-70, sérum humain contenant des autoanticorps anti-scl-70 dans une solution tampon contenant de l azide de sodium 0,09 % Avertissements 1. Tout le matériel d'origine humaine utilisé pour la préparation des contrôles a été testé et trouvé négatif lors de la recherche d'anticorps anti-vih, anti-antigène de surface de l'hépatite B et anti-virus de l Hépatite C à l'aide de tests approuvés par la FDA. Cependant, aucune méthode ne peut donner une garantie complète quant à l'absence de VIH, de VHB, du VHC ou d'autres agents infectieux. Par conséquence, tous les sérums humains de contrôle doivent être manipulés avec les mêmes précautions que celles utilisées pour un matériel potentiellement infectieux L azide de sodium (NaN 3 ) est utilisé comme conservateur. Le NaN 3 est un poison et il est toxique en cas d ingestion et de contact avec les yeux et la peau. Eviter de l exposer aux bases, métaux ou autres composants réagissant avec les acides. Après l évacuation des réactifs, laver à grande eau afin d éviter des dépôts dans les canalisations. 3. Lors de la manipulation de ces produits, utiliser les équipements de protection personnelle appropriés. 4. Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées immédiatement. Respecter les règlements en vigueur concernant l élimination des déchets. Précautions 1. Ce test est destiné au diagnostic in vitro. 2. Toute substitution par d autres réactifs que ceux fournis dans le coffret entraîne des variations de résultats. 3. Il est recommandé d utiliser de l eau distillée stérilisée ou déionisée pour réhydrater l antigène. 4. Divers facteurs influencent la performance de l analyse. Ils comprennent la température de départ des réactifs, le fait d empêcher les réactifs ou échantillons des patients de déborder des puits et la qualité de l eau utilisée pour réhydrater l antigène. Une attention particulière à l uniformité des choix est nécessaire pour obtenir des résultats exacts et reproductibles. 5. Il est recommandé de suivre exactement le protocole. Conditions de conservation Conserver toutes les trousses de réactifs à une température entre 2 et 8 C. Ne pas congeler. Les réactifs conservés et manipulés suivant les instructions resteront stables jusqu à la date de péremption. Après sa réhydratation, l antigène restera stable pendant une période de 2 semaines à une température entre 2 et 8 C. Au besoin, des aliquots d antigène de 100 μl peuvent être préparés et conservés à < -70 C. Les antigènes conservés dans ces conditions restent stables pendant une période d au moins 1 an. Echantillons Ce test doit être réalisé avec du sérum. L addition d azide ou autres conservateurs aux échantillons peut affecter le bon déroulement de la procédure. Les sérums contaminés par des agents microbiens, prétraités par la chaleur ou contenant des particules visibles ne doivent pas être utilisés. Les échantillons hémolysés ou lipémiques sont à éviter. Après prélèvement, le sérum doit être séparé du culot. Le document H18-A2 du NCCLS recommande les conditions suivantes de conservation: 1) Conserver les échantillons à température ambiante pas plus de 8 heures. 2) Si le test ne peut pas être effectué dans les 8 heures, conserver les échantillons à 2-8 C. 3) Si le test ne s effectue pas dans les 48 heures ou si on doit envoyer les échantillons, les congeler à 20 C ou à plus basse température. Bien agiter les échantillons décongelés. Procédure Matériel fourni 8 Plaques de titrage Nova Gel «T» préperforées 2 0,4 ml d antigène Scl-70, lyophilisé 1 1,4 ml de Contrôle Scl-70 Autre matériel nécessaire non fourni Micropipettes distribuant un volume de 15 à 100 μl Embouts de micropipettes jetables Sérum physiologique 0,85 % Eau distillée ou déionisée (de préférence stérile) Source de lumière ou boîte de visualisation pour gel 2
3 Méthode 1. Réhydrater l antigène Scl-70 Ouvrir avec précaution une ampoule d antigène et ajouter 0,4 ml d eau distillée ou déionisée à l antigène lyophilisé. Il est fortement recommandé d utiliser de l eau distillée ou déionisée stérile afin d assurer une performance maximale du produit. Attendre 5 minutes afin de permettre à l antigène de se réhydrater, puis bien homogénéiser avant utilisation. 2. Remplissage de la plaque à gel Préparer une dilution double en série de l échantillon du patient dans 0,85 % de sérum physiologique. Remplir les puits des plaques à gel avec de l antigène (environ 80 μl), un Contrôle (environ 80μl et des dilutions de l échantillon du patient (environ 80 μl) tel qu illustré. Il n est pas absolument nécessaire de respecter des volumes de remplissage exacts ; toutefois, ÉVITER DE FAIRE DÉBORDER LES PUITS. Le Contrôle peut être rempli à l aide de pissettes en plastique ou de micropipettes. Si des pissettes en plastique sont utilisées, placer l embout distributeur dans le puits et presser délicatement jusqu à ce que le niveau du Contrôle atteigne presque le haut du puits. Couvrir la plaque immédiatement après l avoir remplie. 3. Incubation Laisser incuber les plaques couvertes à température ambiante sur une surface plate et stable pendant 24 heures. Examiner les plaques et noter tout arc de précipitation qui se forme entre l échantillon du patient et l antigène. Examiner le rapport entre cet arc et l arc de précipitation de l un ou l autre Contrôle. Réexaminer à nouveau les plaques après 48 heures pour vérifier si de nouveaux arcs se sont formés avant d effectuer l interprétation définitive des résultats. Contrôle de qualité Les tests des Contrôle Scl-70 devraient être effectués sur chaque plaque pour s assurer que la procédure ait été exécutée correctement. Des Contrôles supplémentaires peuvent être préparés à partir d un pool d échantillons de sérum humain. Les aliquots devant être conservés à < -70 C. Pour que les résultats des tests soient considérés valides, un arc de précipitation doit être visible entre les puits des Contrôle Scl-70 et celui de l antigène Scl-70. Interprétation des résultats Pour une observation optimale des arcs de précipitation, il est recommandé de suivre la procédure ci-dessous : 1. Retirer le couvercle de la plaque. 2. Tenir la plaque dans une position qui minimise tout reflet sur la surface du gel. 3. Illuminer la plaque de gel d un côté (à savoir parallèlement à la surface du gel). Remarque : vérifier que la source de lumière n est pas directement visible. 4. Les arcs de précipitation sont plus visibles lorsqu ils sont en contraste sur un fond foncé et visualisés sous un certain angle. 5. Une loupe peut s avérer utile pour l observation des arcs à peine visibles ou la distinction des échantillons de non-identité. Réaction négative. Un échantillon sera considéré négatif si, au bout de 48 heures, aucun arc de précipitation visible ne s est formé entre les puits du patient et le puits de l antigène. Interprétation de la spécificité. Lors d une immunodiffusion sur plaque, la spécificité est définie en notant le rapport entre les arcs de précipitation des échantillons et les arcs Contrôles connus. Les possibilités suivantes existent avec le test NOVA Gel TM Scl-70 : 3
4 Figure 1 : Non-identité Fig. 2 : Identité Scl-70 L arc de précipitation du patient croise ou indique une non-identité avec les Contrôles Scl-70. Ceci indique que le patient a réagi à un antigène ENA autre que Scl-70. L arc de précipitation du patient rejoint ou indique une identité avec l arc du Contrôle Scl-70. Dans ce cas, des autoanticorps anti- Scl-70 sont présents chez le patient. Limites du test 1. Bien qu il soit peu probable dans ce test du fait de la dilution en série de l échantillon, l effet de prozone peut se produire. L effet de prozone se produit lorsqu une quantité massive d autoanticorps du patient est présente, comparée à l antigène (excès d anticorps), entraînant la formation de l arc de précipitation sur la face du puits de l antigène Dans de tels cas, un nouveau test des échantillons positifs ayant des dilutions plus élevées en sérum physiologique est recommandé afin d éviter toute interprétation faussement négative du test. 2. Si de l eau non-stérile ou contaminée est utilisée pour réhydrater l antigène, ce dernier risque de se dégénérer immédiatement ou progressivement. Ceci pourrait résulter dans un arc de précipitation à peine visible ou l absence d un arc. 3. Les résultats obtenus à l aide de ce test devront être corrélés avec les signes cliniques et d autres tests sérologiques. 4. Les performances du coffret pour les échantillons autres que les sérums n ont pas été établies. Performances Le test NOVA Gel TM Scl-70 d immunodiffusion sur plaque a été utilisé afin d évaluer plusieurs patients atteints de maladies des tissus conjonctifs ainsi que 200 donneurs de sang choisis au hasard. Les résultats sont fournis ci-dessous : Groupe de patients Nombre Nombre de tests NOVA Gel ENA positifs Scl-70 Positiff SLE Lupus d origine 24 0 médicamenteuse Arthrite rhumatoïde 40 0 Sclérodermie Dermatomyosite 14 0 Syndrome de Sjogren 14 0 Normaux Références 1. Tan E. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan E, et al. The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ, Myers LL. Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Catoggio LJ, et al. Serological Markers in progressive systemic sclerosis. Clinical Correlations, Annals of the Rheumatic Diseases 42:23-27, Takehara K, Moroi Y, Ishibasi Y. Antinuclear antibodies in the relatives of patients with systemic sclerosis. Br J Dermatol 112:23, Jarzabek-Chorzelska M, Blaszczyk M, Jablonska S, Chorzelski T, Kumar V, Beutner E. Scl-70 antibody-a specific marker of systemic sclerosis. Br J Dermatol 115: , Kumar V, et al. A standardized method of detecting antibodies to extractable nuclear antigens (RNP and Sm) by gel precipitation. J Clin Lab Immunol 15: , Stein V, et al. Clinical Correlations and Prognosis Based on Serum Autoantibodies in Patients with Systemic Sclerosis. Arthritis and Rheumatism 31:2, Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. Prog Allergy 5:1,
5 10. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999 Fourth Edition (HHS Pub. # (CDC) ). Fabricant: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Représentant Autorisé: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service December 2007 Revision FRA9 5
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