ECOLE DOCTORALE ENERGIE ENVIRONNEMENT ALLOCATIONS DE RECHERCHE CONCOURS 2016

Transcription

1 Ecole Doctorale Energie Environnement Université de Perpignan Via Domitia 52 Avenue Paul Alduy Perpignan ECOLE DOCTORALE ENERGIE ENVIRONNEMENT ALLOCATIONS DE RECHERCHE CONCOURS 2016 SUJET DE THÈSE : Nouvelles sondes électrochimiques pour le marquage de biocapteurs d affinité Mots clefs : Biocapteurs d affinité, électrochimie, complexes métalliques, micropolluants, résidus médicamenteux, effluents, eau. Laboratoire «Biocapteurs, Analyse, Environnement» BAE, Université de Perpignan Via Domitia Directeur du laboratoire : Pr T. Noguer Directeur de thèse : C. Calas-Blanchard (MCF, HDR) (calas@univ-perp.fr / ) (en collaboration avec le CRIOBE, N. Inguimbert (Pr)) I Contexte environnemental et réglementaire Le contrôle et la surveillance de la contamination de l'eau constituent une tâche prioritaire dans le domaine de l'environnement et de la santé publique et de nouvelles directives apparaissent afin de réguler l'utilisation de nombreux composés chimiques. Parmi celles-ci, la Directive Cadre sur l Eau (2000/60/CE), transposée en droit français (Loi du 21 avril 2004) a confirmé l enjeu majeur de réduire les pollutions toxiques. L arrêté du 8 Juillet 2010 établit une liste de 33 substances prioritaires et fixe les modalités et délais de réduction progressive et d'élimination des déversements, écoulements, rejets directs ou indirects respectivement des substances prioritaires et des substances dangereuses prioritaires. Cette liste a été enrichie en 2013 par 12 nouvelles substances, et il a été créé en parallèle une liste dite «de vigilance» pointant du doigt 3 substances pharmaceutiques : un anti-inflammatoire non stéroïdien le diclofénac (DCN) et deux hormones estrogéniques, l une naturelle : le 17β-estradiol (βe2), et l autre synthétique : l éthinylestradiol (EE2).

2 Contrairement à d autres substances médicamenteuses spécifiques des effluents hospitaliers, ces substances sont «relarguées» par une large frange de la population, elles se retrouvent à de très faibles teneurs dans les eaux usées urbaines et sont faiblement éliminées par les traitements réalisés au niveau des stations d épuration. Il en résulte une pollution urbaine diffuse, difficile à traiter, qui nécessite le développement d outils de contrôle très sensibles et utilisables sur le terrain. II Contexte scientifique Le projet de Recherche «Capt avenir», dans lequel s intègre ce sujet de thèse, est financé à hauteur de 98 k par la région Languedoc-Roussillon (Fonds FEDER) dans le cadre du programme «Chercheur(se)s d Avenir 2015». Il vise à améliorer et à faciliter les capacités de contrôle des polluants émergents par l'intégration d'un système de surveillance des résidus de médicaments et assimilés. L'objectif principal est de produire des systèmes de mesure innovants et robustes basés sur la technologie des biocapteurs pour la détection des trois substances appartenant à la liste de vigilance dans les influents et effluents de STEP et dans les eaux superficielles. Les biocapteurs sont des outils analytiques associant un élément biologique, appelé biorécepteur, permettant la reconnaissance spécifique du polluant cible, et un transducteur physique assurant la production d un signal analogique mesurable. Classiquement, les bioessais développés pour la détection des polluants émergents sont des immunoessais dont le principe repose sur une détection compétitive de la molécule cible. Cette méthodologie est dictée par la petite taille de ces molécules, qui ne possèdent qu un épitope et pour lesquelles il est impossible de développer des tests en sandwich. Concrètement, un dérivé de la molécule cible est immobilisé sur un support poreux (polycarbonate) et est mis en présence d anticorps spécifiques, généralement des anticorps monoclonaux. En présence de la molécule cible, les anticorps présents en quantité limitante, se fixent de manière compétitive sur la cible immobilisée et sur la cible libre. Après une étape de lavage, les complexes cible-anticorps libres sont éliminés et la réponse résiduelle est mesurée (Fig. 1). Figure 1 : Principe d un immunoessai compétitif avec antigène immobilisé ; a : en absence de cible libre (réponse maximale) ; b : fixation compétitive en présence de la cible libre ; c : après lavage (réponse résiduelle).

3 Une étape primordiale à la mise en œuvre d immunoessais consiste en la révélation du complexe antigène-anticorps. Dans les immunoessais de type ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), cette révélation est réalisée grâce à des anticorps secondaires polyclonaux qui sont marqués par une enzyme, généralement une peroxidase. L utilisation d un substrat chromogène de cette enzyme permet la libération d un produit coloré, facilement mesurable par colorimétrie (Fig. 2). Figure 2 : Principe de la révélation par un anticorps secondaire marqué par une enzyme Malgré leur sensibilité et leur spécificité (qui dépend grandement de l anticorps primaire utilisé), ces méthodes immunochimiques souffrent d une certaine lourdeur, principalement en raison des nombreuses étapes de lavage et d incubation nécessaires à la révélation. L essor des technologies associées aux biocapteurs au début des années 2000 a vu l émergence des immunocapteurs, basés sur les mêmes principes que les tests ELISA, mais faisant intervenir des méthodes de détection plus sensibles, principalement basées sur des techniques optiques ou électrochimiques. Ainsi, un certain nombre de capteurs ont vu le jour permettant la détection directe de l interaction antigène-anticorps, ils sont essentiellement basés sur des techniques de mesure gravimétriques (microbalance à cristal de quartz) ou refractométriques (résonance de plasmons de surface, interférométrie de Mach-Zehnder). Malgré leur attractivité, ces méthodes font intervenir des appareillages coûteux fonctionnant en flux et sont cantonnées à une utilisation de laboratoire. En conséquence, la plupart de immunocapteurs décrits dans la littérature reposent sur un marquage fluorescent ou enzymatique, de la même manière que les immunoessais classiques, et sont sujets aux mêmes inconvénients que ces derniers. Le développement de techniques de marquage efficaces et sensibles reste donc un défi pour l essor des immunocapteurs, et par extension de tous les capteurs faisant intervenir des interactions affines non catalytiques. Parmi ces derniers, on peut citer les capteurs aptamériques, pour lesquels des oligonucléotides d ADN sont utilisés comme molécules de reconnaissance. Ces aptamères sont sélectionnés par une méthode itérative appelée SELEX ; outre leur grande affinité, ils présentent l avantage d être chimiquement plus stables que les anticorps et de pouvoir être modifiés par greffage d un marqueur aux différents groupements fonctionnels introduits lors de leur synthèse.

4 III Sujet de thèse L objectif de cette thèse est de développer des méthodes de marquage alternatives au marquage enzymatique, basées sur l utilisation de complexes métalliques électroactifs. Une partie du travail concernera la synthèse de différents complexes de vanadium ou de cuivre et leur caractérisation électrochimique. Lors d une précédente thèse, un de ces complexes a pu être greffé à un haptène pour la réalisation d un immunocapteur de type compétitif [Kanso et al., 2014]. Ces travaux, publiés dans la revue «Chemical Communications», ont permis d apporter une première preuve de concept montrant la possibilité d utiliser ces complexes comme marqueurs au sein d immunoessais. Au cours de cette thèse, des complexes métalliques du même type seront sélectionnés et greffés dans un premier temps, sur des anticorps secondaires (anti-igg) polyclonaux ou des anticorps primaires monoclonaux. Différentes approches de couplage seront abordées permettant la fixation rapide de ces complexes sur la biomolécule. Le marquage électrochimique de l élément «biologique» permettra de s affranchir de l étape d ajout du substrat enzymatique. Différents formats seront envisagés afin d optimiser les performances des tests pour chacune des cibles étudiées. Dans un deuxième temps, les mêmes complexes métalliques seront utilisés pour le marquage d aptamères, dans l optique de réaliser une détection directe, non compétitive, de la molécule cible (figure 3). Figure 3 : Principe d un aptacapteur électrochimique à détection directe Les systèmes développés pourront ensuite être miniaturisés et transposés à la technologie «lab-ona-chip» (laboratoire sur puce) pour la détection des polluants émergents ciblés par l étude. Référence bibliographique : H. Kanso, N. Inguimbert, L. Barthelmebs, G. Istamboulie, F. Thomas, C. Calas-Blanchard, T. Noguer. Chem. Com., 50 (2014) IV Plan de travail Pour atteindre les différents objectifs scientifiques énoncés, cette thèse s articulera autour de 6 tâches principales détaillées ci-après : Tâche 1 : Etude bibliographique Tâche 2 : Synthèse des complexes métalliques Des complexes métalliques de cuivre ou d oxovanadium seront synthétisés à partir de ligands tétradentate de type salen ou salan. Le candidat recruté se basera sur de précédents travaux réalisés dans le cadre de la thèse de M. H. Kanso (Financement sur projet de recherche européen). Ce travail sera réalisé en collaboration avec Pr. N. Inguimbert du laboratoire CRIOBE (Université de Perpignan Via Domitia).

5 Tâche 3 : Caractérisation électrochimique des complexes métalliques Une fois synthétisés, les complexes métalliques seront caractérisés par différentes méthodes (voltammétrie cyclique, voltammétrie à impulsion différentielle ) afin de définir leurs caractéristiques électrochimiques en termes de réversibilité, de potentiels oxydation/réduction, de densité de courant. Le complexe présentant les meilleures caractéristiques sera sélectionné en vue de la conception des capteurs. Tâche 4 : Greffage du complexe sélectionné sur des biomolécules (anticorps, aptamères) Plusieurs méthodologies seront envisagées, faisant intervenir des techniques de couplage conventionnelles. L utilisation de bras espaceurs sera envisagée afin de favoriser la détection électrochimique. Tâche 5 : Réalisation des capteurs (différents formats) pour les différents polluants cibles Pour chacun des polluants cibles, différents formats de capteurs seront testés afin de retenir la configuration donnant les meilleures performances analytiques en termes de sensibilité, spécificité et gamme de linéarité. Tâche 6 : Validation des outils analytiques par méthodes conventionnelles Les outils analytiques développés seront validés en utilisant comme méthode de référence la chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse. Le laboratoire fera appel à la plateforme technologique «Technovie, Bio2mar».