Électrophorèse capillaire CHM 3102

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2 Vue d ensemble Tampon Électrode Échantillon Alimentation électrique Détecteur Tampon Électrode Séparation basée sur la migration différentielle des solutés sous l influence d un champ électrique. Séparation s effectue dans des tubes de silice fondue de petit diamètre (25µm to 75 µm id) Haut voltages (10 to 30 kv) et haut champs électriques (100 to 500 V/cm) sont appliques aux extremités du capillaire. Haute résistance du capillaire limite la generation de courant et l effet Joule. Grande efficacité (N>10 5 to 10 6 ) et rapidité d analyse. Détection en ligne (pas de cellule externe). Petit volume d injection (1 to 50 n) Différents modes de séparation et application. Séparation en milieu aqueux Automatisation 2

3 Support de séparation silice Matériel le plus utilisé pour les capillaires Tubes résistants (polyimide) et de petit diamètre Haute constante diélectrique (isolant) Haute transmission UV Faible fluorescence Gaine de polyimide (~15 µm) Diamètre interne (25100 µm) Diamètre externe (70500 µm) 3

4 instrumentation Cartouche avec capillaire à T contrôlée Compartiment à T contrôlée Détecteur (DAD) Carrousel d échantillon et de tampons Agilent HP 3D Capillary electrophoresis system 4

5 Conversion des unités 1 Joule (J) 1 kg.m 2.s 2 1 centipoise (cp) 10 3 kg. m 1.s Pa.s 1 psi x10 3 Pa 1 Coulomb (C) 1 J.V 1 1 kg.m 2.s 2.V 1 5

6 Notions de base velocité Détecteur Champ électrique: Analytes Tampon d t Tampon E dv dx V anode t V cathode Force électromotrice et frictionnelle où Électrode Alimentation électrique Électrode q est la charge électrique possédée par un ion i (C), E est le champ électrique (V/m), f est le coefficient de friction (cp m), pour un ion sphérique η est la viscosité du milieu (cp), Champ électrique (V/cm) Charge v est la vitesse linéaire de la particule i (cm/s), dans un champ électrique q E f v r i est le rayon hydrodynamique (ionique) de la particule i, (une forme sphérique) (m). Coefficient de friction et f 6 π η r i Vélocité (m s 1 ) 6

7 Notions de base Mobilité ionique v q E f q 6πηr On définit la mobilité électrophorètique de l ion comme: i E Caractéristique physicochimique de l ion d intérêt Donc: µ v q 6πηr i ep. en unités de m 2 V 1 s 1 ep µ ep i E a mobilité électrophorètique, µ ep, et donc la vitesse électrophorètique, v ep, dépend du milieu: ph et composition du tampon (force ionique, viscosité, etc.). 7

8 Notions de base séparation Mélange équimolaire Asp, Gly, et ys tampon tris, ph 6.0 Temps Assigner les différents pics observés et justifier leurs positions relatives. 8

9 Notions de base électroosmose a silice fondue (SiO 2. H 2 O) possède des groupements silanols ionisables lui confèrant des propriétés acides pk a ~ 6 (pi ~ 1,5) SiOH SiO H a silice fondue en contacte avec le tampon formera une double couche électrique à la paroi du capillaire: NaOAc H 2 O Na OAc H 3 O OH O O O Si Si Si Si O O O 9

10 Notions de base électroosmose Que se passe t il suite à l application du voltage? a migration des cations solvatés de la couche diffuse occasionne un déplacement vers la cathode, lequel est appellé électroosmose Silice fondue avec cations fortement adsorbés e potentiel Zeta correspond au potentiel associé à la couche diffuse Zone diffuse de la double couche avec une prédominance de cations Potentiel (mv) ζ couche diffuse Solution épaisseur de la double couche électrique Distance à partir de la paroi du capillaire (nm) épaisseur de la couche diffuse est d environ 10 nm pour une force ionique de 1 mm et 0.3 nm à 1 M. 10

11 Notions de base électroosmose e potentiel zeta associé à la couche diffuse est obtenue à partir de l équation de Helmholtz où : µ eo est la mobilité électroosmotique (m 2 V 1 s 1 ) ε est le constant diélectrique du milieu ζ est le potentiel Zeta (quelques mv) η est la viscosité du milieu (cp) veo µ eoe ς ε ς E 4π η 4π η µ ε Donc la mobilité électroosmotique, µ eo, et la vitesse électroosmotique, v ep sont obtenu par: eo 11

12 Notions de base les mesures de mobilité e mouvement d un soluté chargé à travers le capillaire est la somme des deux phénomènes : électrophorèse et électroosmose. On définit la vélocité apparente (vélocité totale) d un soluté, v app, et la mobilité apparente µ app comme: v µ app app v µ ep ep v µ eo eo ( où µ q ep et µ eo 6 π η r ε ς 4π η ) v app ( µ ep µ eo ) E 12

13 Notions de base les mesures de mobilité d t Détecteur vapp ( µ ep µ eo )E Analytes Tampon Tampon v app t d m et E V t Électrode Électrode Alimentation électrique donc t m v d app d t ( µ µ ep eo ) V 13

14 Notions de base Caractéristique du débit électroosmotique A pressure driven parabolic flow temps voltage driven electroosmotic flow A temps e débit électroosmotique issu de la couche diffuse est uniforme et a un profile étroit contrairement à celui associé aux systèmes utilisant une pression appliquée pour éluer les analytes (HPC). e débit électroosmotique ne cause pas un élargissement significatif de la bande. 14

15 Notions de base l ordre d élution v eo v ep v app Mais aussi: v q 6πη r i E 15

16 Notions de base calculs de mobilité (307 s) (353 s) (416 s) Séparation effectuée à 20 kv dans un capillaire de 60 cm (50 cm au détecteur) v eo Temps Quelle est la mobilité electrophorétique de chaque acide aminé (ordre est le meme que précédemment? 16

17 Notions de base efficacité et plateau théorique En chromatographie liquide H A B u Cu Diffusion d Eddy, chemin multiple Résistance au transfert de masse En electrophorèse capillaire electroosmose ne cause pas d élargissement significatif mais affecte le temps auquel un ion prendra pour etre detecte. Seul la diffusion longitudinale a un impact important sur la diffusion des bandes. 17

18 Notions de base efficacité et plateau théorique coefficient de diffusion (m 2 s 1 ) t m v d app ( µ ep d t µ eo ) V et σ 2 2D m t m D m (x10 11 m 2 s 1 ) Glycine Insulin 8.2 Hemoglobin 6.3 Catalase 4.1 Urease 3.5 Tob. mos. virus 0.53 σ 2 2 ( µ ep D m µ d eo t ) V et H 2 σ d 2tD µ app. V m Aussi: N 16 t w m b 2 N H d µ app. 2 D V m d t 18

19 Notions de base résolution R ( t t ) mb ma 2 d t et t m wb w ( µ app.) V A R N 4 µ ep µ ep µ eo et N µ app. V 2 D m d t 19

20 Facteurs affectant l efficacité et sources de variance σ 2 obs. σ dif.2 σ inj.2 σ temp.2 σ ads.2 σ det.2 σ k2... dif.: Diffusion longitudinale, limite fondamentale déterminée par le coefficient de diffusion inj.: ongueur de la bande d injection doit être moindre que la longueur associée à la diffusion. Contrainte de sensibilite nécessite bien souvent un compromis. temp.: Effet Joule et gradient de T avec augmentation de V ads.: Interaction de l analyte avec la paroi du capillaire det.: Détecteur être relativement petit p/r à la largeur de pic. k: Différence de conductivité entre l analyte et le tampon 20

21 Température Tampon Silice Polyimide r (µm) T (paroi) T T Environnement extérieur d (µm) HPCE An introduction D. Heiger es effets d échauffement peuvent causer un gradient de température nonuniforme, un changement local de viscosité, et une diffusion de l analyte. augmentation de V peut avoir des effets néfaste lorsque l effet Joule (augmentation de T suite au passage de courant électrique celleci dépendant de la puissance V. I). 21

22 Volume d injection Variance associée a l injection : σ inj.2 ( t m ) 2 /12 σ 2 dif. 2D m t m H 2D v t max 24D m eht m argeur de la bande d injection; doit être < à la déviation std associée à la diffusion t max : argeur max. acceptable de la bande e h : Accroissement acceptable de H obs. comparativement a H min (dif. seul.) E.Grushka, R. McCormick, J. Chrom., 471, 421 (1989) 22

23 Volume d injection e nombre de plateau varie significativement avec le volume d injection. a variance associée à la diffusion représente la limite minimale d élargissement et N max. Celleci varie egalement avec Dm. De façon pratique on limite la longueur de la bande d injection à ~ 1% de ~ N W/ Glycine insulin ~ : 0.7 m t m : 600 s 23

24 Adsorption a variance associée due l adsorption à la surface du capillaire est exprimée par: 2 ads 2 k' veod r k' 2 ( ) 2 d k' 4Dm Kd σ où: k : Facteur de capacité On voit que qu une augmentation significative de σ 2 ads survient lorsque k (t m t eo /t eo ) augmente et ce même avec k <1. a séparation de protéines avec CE peut devenir problématique a cause de l adsorption à la surface. Afin de limiter cette source d élargissement de pic on peut diminuer les charge effective à la surface en augmentant la force ionique, en diminuant le ph ou en modifiant la surface du capillaire. v eo : vélocité électroosmotique D m : Coeff. diffusion K d : Const. de dissociation r: Rayon du capillaire HPCE An introduction D. Heiger 24

25 Electrodispersion et différence de conductivité a différence de conductivite, k entre la zone de l analyte et celle du tampon avoisinant est donnée par: k σ 2 k CF µ ( µ µ )( µ µ ) B ( µet) 16 2 k ke C e 2 où: C: Concentration de l analyte F: Constante de Faraday µ: Mobilité de l analyte µ B : Mobilité de l ion de même charge que l analyte µ C : Mobilite de l ion de charge opposé à l analyte k e : Conductivité du tampon Hjerten, S. Electrophoresis, 11, 665 (1990) 25

26 Electrodispersion et différence de conductivité Échantillon de faible conductivité κ < κ e Échantillon de conductivité comparable κ ~ κ e Échantillon de grande conductivité κ > κ e Pour un échantillon de faible conductivité, l analyte entrera dans la region du tampon moins rapidement car le champ électrique est plus faible. Pour un échantillon de grande conductivité, l analyte entrera dans la region du tampon plus rapidement car le champ électrique est plus grand. Pour minimiser les effects de diffusion associes aux differences de conductivite on ajuste le tampon pour avoir k e /k e <0.5%. Tampon µ 26