Analyses moléculaires dans les cancers du sein
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- Florent Laviolette
- il y a 7 ans
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1 Analyses moléculaires dans les cancers du sein Anne Vincent-Salomon Département de Pathologie et INSERM U830 Institut CURIE PARIS, France
2 Echantillons de tumeur à l état frais FIXATION CONGELATION Analyse morphologique Analyse morphologique Immunohistochimie (protéine) FISH (ADN) Analyse moléculaire (ADN, ARN, microarn) Facteurs pronostiques Facteurs prédictifs Cibles thérapeutiques
3 1. Préparation du matériel pour analyse moléculaire Tumoral : Congélation rapide < 30 minutes après ischémie post-opératoire et / ou la biopsie Zone représentative de la tumeur (pas de nécrose, pas de trace de biopsie) Normal pour ADN de référence : Tissu normal péritumoral Sang périphérique Recueil des consentements des patientes
4 Processus pour la préparation des ARN et ADN à partir des échantillons tumoraux cryopréservés Fragment tumoral congelé Validation de la Richesse en cellules tumorales Cryopreservation d une partie de l échantillon congelé Coupe histologique congelée Analyse microscopique - Type histologique Cellules tumorales 80% + Stroma fibroblastique 20% -Evaluation : -% cellules tumorales -% cellules inflammatoires -% du stroma et sa nature -% tissu normal
5 Processus pour la préparation des ARN et ADN à partir des échantillons tumoraux cryopréservés Fragment tumoral congelé Cryopreservation d une partie de l échantillon congelé Coupe histologique congelée Validation de la Richesse en cellules tumorales Macrodissection - Pour enrichissement en cellules tumorales avant l extraction des ADN et ARN Cellules tumorales 95%
6 Processus pour la préparation des ARN et ADN à partir des échantillons tumoraux cryopréservés Fragment tumoral congelé Cryopreservation d une partie de l échantillon congelé Coupe histologique congelée Validation de la Richesse en cellules tumorales Cellules tumorales 95% ARN Cellules tumorales 95% ADN
7 2. Annotation des échantillons tumoraux (bases de données de qualité) Description du type histologique : exemple des cancers du sein Carcinomes infiltrants du sein Tubuleux Médullaire Lobulaire Canalaire
8 Age Taille tumorale Grade (index mitotique) Emboles Vasculaires Nature du stroma (lymphoïde ) Statut ganglionnaire RO, RP, ERBB2 2. Annotation des échantillons tumoraux (bases de données de qualité) Caractéristiques anatomo-cliniques associées aux échantillons Suivi clinique : modalités thérapeutiques, évolution clinique
9 3. Transfert des résultats issus des analyses moléculaires vers la pratique clinique Techniques moléculaires : Réservées à des centres spécialisés Matériel cryopréservé (difficile à mettre en place dans un système de médecine privée) Transfert en pratique clinique : nécessite une méthode Fiable +++ Reproductible Peu couteuse Largement diffusée
10 3. Transfert des résultats issus des analyses moléculaires vers la pratique clinique L immunohistochimie En hématopathologie : Lymphome T anaplasique ALK positif, activé par translocation t(2;5). Perte d expression de la protéine INI1 dans les tumeurs rhabdoïdes avec mutation somatique du gène INI1. Carcinomes colo-rectaux perte de l expression des protéines MLH1, MSH2 et MHS6 Carcinomes lobulaires infiltrants du sein : mutation du gène de la E-cadhérine L hybridation in situ en fluorescence ou chromogénique Amplifications : ERBB2 Translocations des carcinomes sécrétants juvéniles et adénoides kystiques.
11 Carcinome lobulaire infiltrant du sein : mutation de la E-cadhérine Gene: chr16 en q22.1, gène supresseur de tumeur Protéine: transmembranaire, adhérence inter-cellulaire E-cadherin p120 ctn catenin -catenin or plakoglobin -catenin Schéma adapté de van Roy F-actin
12 Carcinome lobulaire infiltrant du sein : mutation de la E-cadhérine Gene: chr16 en q22.1, gène supresseur de tumeur Protéine: transmembranaire, adhérence inter-cellulaire E-cadherin * p120 ctn catenin -catenin or plakoglobin -catenin Schéma adapté de van Roy F-actin
13 Mutation Perte d expression de la E-cadherine dans la majorité des carcinomes lobulaires infiltrants Contrôle positif interne : Glandes normales résiduelles intra-tumorales
14 Intérêt d identifier les carcinomes lobulaires en pratique clinique Tumeurs lobulaires à faible prolifération 1. Faible réponse à la chimiothérapie néoadjuvante 2. Identification de nouvelles cibles thérapeutiques FGFR1 gène driver de l amplicon du chromosome 8p12 cible d une thérapie ciblée anti FGFR1 (Reis-Filho et al Clin Can Res 2006)
15 ERBB2/ Neu/HER2 Gène: oncogène, situé sur le chromosome 17q12 Protéine = récepteur tyrosine-kinase trans-membranaire ACTIVATION de HER 2 dans les cancers du sein par amplification du gène
16 > 30% de cellules marquées avec intensité forte marquage membranaire complet
17 Pas d amplification Pas de surexpression Amplification forte >15 copies Surexpression forte 3+ Amplification faible 6-10 copies Surexpression faible 2+
18 IHC critères d interprêtation Voir les contrôles, si non conformes, le test doit être répété Ne pas interprêter le cas si marquage évident des glandes normales Score 3+ : >30% de cellules tumorales infiltrantes avec marquage membranaire complet et intense Ne pas tenir compte des marquages incomplets et pâles N interprêter que les cellules carcinomateuses infiltrantes 18
19 Bien identifier les cas équivoques C est à dire ceux à analyser par FISH/CISH CAS 2+ (5 à 15% des cas): Marquage complet soit non uniforme soit faible avec un marquage evident circonférentiel membranaire dans au moins 10% des cellules Cas hétérogènes (exceptionnels :1 cas tous les 3 à 6 mois) ( equivocal, à re-tester par une autre technique) marquage complet et intense de <30% des cellules carcinomateuses infiltrantes
20 Tumeurs HER2 (3+) Canalaires <1cm 9% < 2 cm 10 à 15% > 2 cm 20 à 25% grade I ~ 0% grade II 11% grade III 27% Lobulaires < 5% Tubuleux 0% Médullaires et basal-like 0% Cancers inflammatoires Cancers de la femme jeune 30% 20
21 Cas 2+ : 15% des cas FISH pour compléter l analyse 15-30% sont amplifiés (amplification de faible niveau)
22 5 à 15% 70 à 80% 15% Wolff et al JCO 2007
23 Principe de l Hybridation in situ en fluorescence Sur coupes tissulaires Sonde spécifique anti HER2 Cible : séquence chromosomique de HER2 Coupe tissulaire fixée de carcinome mammaire
24 Sondes HER-2 et centromère 17 HER-2 2 copies Amplifié >20 copies centromère 17
25 HER-2 faible amplification - surreprésentation HER-2 cen 17
26 FISH Résultats HER-2:. 1-4 copies: pas d'amplification. > 6 copies: amplification HER2/cen 17:. HER2/cen 17 < 2.2: pas d'amplification. HER2/cen 17 > 2.2 : amplification
27 Trastuzumab (Herceptin ) Mécanismes d action Burstein NEJM 20 Octobre 2005
28 Classification moléculaire des carcinomes infiltrants de type canalaire Récepteurs Oestrogènes - Récepteurs Oestrogènes + Basal-like ERBB2 Luminal A, B, C Pronostic défavorable Sorlie et al, PNAS 2001
29 Fréquence des types moléculaires définis par immunohistochimie Luminal A 44%; Luminal B 24%; Luminal HER2 6,5%; BLC 9,8%; TN non BCL 8,5% Luminal A= RO + et /ou RP +, Ki67 <14% ou grade I / II (index mitotique bas) Luminal B = RO + et /ou RP +, Ki-67 > 14% ou grade II (index mitotique fort) ou III luminal/her2 = RO + et/ou RP + et HER2 + HER2 = RO- /HER2+ Basal-like = RO 0% et RP 0% et HER2 0 et EGFR + et /ou CK5/6 + Triple-negative (TN): = tumors that did not express EGFR or CK5/6 were considered = TN non basal Kennecke et al JCO 2010
30 Immunophénotype des carcinomes infiltrants de type basal-like 10-15% des carcinomes mammaires infiltrants 85% des carcinomes BRCA1 Grade III et phénotype RO-RP- ERBB2- pas de thérapeutique ciblée Mauvais pronostic : 55 à 70% de survie à 10 ans RO- RP- ERBB2-100 % KRT5/6+ 62% EGFR 57% KIT+ 29 % Critères définis par Nielsen et al, Clin Can Res 2004 Spécificité de 100% et sensibilité de 78%
31 Identification des carcinomes basal-like en pratique clinique Contours arrondis Peu différencié, Nécrose Grade III / Mitoses Stroma lymphoïde Stroma myofibroblastique Atypies
32 Spectre morphologique des carcinomes triples négatifs 15-18% des carcinomes mammaires Secrétants juvéniles Triples négatifs Adénoïdes kystiques t(12;15) (ETV6; NTRK3) t(6;9) (q22-23; p23-24) (MYB ;NFIB) Basal-like Sporadique ou BRCA1 Médullaires Métaplasiques
33 Conclusions : Pathologie moléculaire dans les cancers du sein 1. Collection et préparation du matériel tumoral de qualité enrichissement en cellules tumorales 2. Annotations clinico-pathologiques détaillées corrélations moléculaires / phénotypiques identification fiable de nouvelles cibles thérapeutiques 3. Transfert en pratique clinique des avancées de la recherche pour : diffusion au plus grand nombre de patientes adaptation des schémas thérapeutiques aux sous-types tumoraux
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