CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES INDUITES (ips) : APPLICATIONS AUX PATHOLOGIES GÉNÉTIQUES ET LIMITES
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- Jacqueline Brosseau
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1 CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES INDUITES (ips) : APPLICATIONS AUX PATHOLOGIES GÉNÉTIQUES ET LIMITES Pr John DE VOS Département d Ingénerie Cellulaire et Tissulaire INSERM IRMB Hôpital St Eloi - CHU de Montpellier
2 CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES
3 Induced pluripotent stem cells (ips) OCT4 SOX2 cmyc KLF4 Sang peau coeur neurones 2006 S Yamanaka Nobel Price 2012 K. Takahashi and S. Yamanaka. Cell, 126:663, 2006.
4 Applications 1. Modélisation in vitro du développement normal et des maladies génétiques 2. Une source illimité de cellules pour la thérapie cellulaire potentiellement autologues 3. Un moyen de rajeunir des cellules âgées voire sénescentes
5 MODELLISATION DE PATHOLOGIES GENETIQUES
6
7 BetaIII Tubulin MAP2 ips Progéniteurs neuronaux Neurones 11j 21j Israel MA et al. Nature, 2012, 482:
8 Israel MA et al. Nature, 2012, 482:
9
10 ESSAIS CLINIQUES
11 ESSAIS CLINIQUES Kimbrel EA et al. Nature Reviews Drug Discovery, :
12 Menasche P et al. European Heart Journal, :
13 LIMITES
14 ips = ES? o Anomalies épigénétiques o Anomalies génétiques secondaires à la reprogrammation o N est pas retrouvé par tous (sauf mutagénèse insertionnelle!): dépend du protocole de reprogrammation? Q. Bai, R. Desprat, B. Klein, J.-M. Lemaitre, and J. De Vos, Embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells? A DNA integrity perspective., Curr Gene Ther, vol.
15 L essentiel de la variabilité vient du fond génétique [1] F. Rouhani,et al., Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells., PLoS Genet, vol. 10, no. 6, p. e , Jun
16 ips = ES!
17 ANOMALIES GENETIQUES INDUITES PAR LA CULTURE
18
19 1. Chronologie et déterminants de cette instabilité 1. A quelle vitesse les anomalies apparaissent-elles? 2. Impact des conditions de culture (passage) 3. Anomalies de caryotype vs infra-caryotypique? 2. Quelles anomalies génétiques? 3. Conséquences?
20 CHRONOLOGIE ET DETERMINANTS
21 Impact de la dissociation cellulaire : adaptation Passage mécanique Dissociation cellulaire (trypsine)
22 Impact de la dissociation cellulaire : adaptation Passage mécanique Dissociation cellulaire (trypsine) + inhibiteur ROCK (ou forte concentration cellulaire
23 Adaptation à la dissociation cellulaire + inhibiteur ROCK (ou forte concentration cellulaire Après 5 à 10 passages : adaptation Anomalies génétiques
24 ETUDE DES ANOMALIES GENETIQUES INDUITES PAR LE STRESS DE LA DISSOCIATION CELLULAIRE o Comparaison d un passage mécanique vs. enzymatique o 3 lignées ES humaines à passage précoce: o HD129: p16 et HD291: p13; HS306: p25 o Trois techniques d analyse génétique: o Caryotype o Puces à AND SNP 6.0 (Affymetrix) o NGS
25 Anomalies caryotypiques Bai et al. Stem Cell Dev, 2015
26 Anomalies caryotypiques Bai et al. Stem Cell Dev, 2015
27 Copy Number Variation (CNV) Bai et al. Stem Cell Dev, 2015
28 NGS o Analyse en cours o Peu de mutations o Hasard ou déterminisme de ces mutations de novo?
29 Conclusion 1 o Instabilité génétique des CSP: o Fortement dépendant du type de passage o Peut-être très rapide (5 passages) o Anomalies caryotypiques et CNV o NB : anomalies de caryotype récurrent mais plutôt tardif, CNV non récurrent et précoce
30 QUELLES ANOMALIES GENETIQUES?
31 Nicolas Girault, Master 2 Said Assou, IR Anthony Boureux, MCU Thérèse Commes, PU John De Vos, PUPH Seadb.org (unpublished)
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33 SEAdb SEAdb Extraction Inventaire de ces anomalies dans les CSP 101 Etudes 905 Echantillons Auteur PMID Année Journal Equipe Type d échantillon Paramètre de culture Méthode de détection Variants Trisomy SNV CNV LOH Délétion Translocation Duplication
34
35 Zoom via a genome browser
36
37
38
39 HOTSPOT FINDER
40 HOTSPOT FINDER
41 HOTSPOT FINDER
42 Translocations
43 Impact de la méthode de passage sur la fréquence des variants Enzymatic Mechanic
44 Conclusion 2 o Les principales anomalies génétiques récurrentes: o Aneuploïdies o Et des gains > 1Mb o Ce sont des anomalies «hyperrécurrentes»
45 ALTERATION DU TRANSCRIPTOME
46 COPY NUMBER EFFECT
47 COPY NUMBER EFFECT? o 320 probesets avec au moins un FC > 4 dans une lignée (max : 119,04) o 22 probesets localisées sur un CNV (max : 7,8)
48 Signature transcriptionnelle caractéristique
49 mrnaseq P0 MP15 EP15 P0 MP15 EP15
50 Long non-coding RNA P0 MP15 EP15 o Certains lncrna induits massivement (> x50)
51 12,5K/cm ² 25K/cm ² 50K/cm ² si GFP si % si % o Knock-down par sirna sur cellules adaptées
52 Conclusion 3 o Modifications transcriptome plus importantes que ne le voudraient les anomalies génétiques o Modifications du phénotype précèdent le changement génétique?
53 Conclusion générale o ips : modèle prometteur d étude des maladies génétiques o Attention aux aneuploïdes induites par la culture o surveillance régulière de la culture (caryotype, FISH?, puces? séquençage?) o ips «naïves»?
54 Present and past members : Engi AHMED Caroline SANSAC Julien BOUCKENHEIMER Jean-Marie RAMIREZ Said ASSOU Arnaud BOURDIN John DE VOS Mathilde PLINET Nicolas AUSSEL Nicolas GIRAULT Qiang BAI Doris CERECEDO COLLABORATIONS Franck PELLESTOR (CHROMOSTEM) Jean-Marc LEMAITRE Outi HOVATTA CHU de Montpellier
55
56 Bai et al. Stem Cell Dev, 2015
57 SWAP Bai et al. Stem Cell Dev, 2015
58 SWAP Bai et al. Stem Cell Dev, 2015
59 Nombre de publications par année
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61
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