Biogenèse et mécanismes d action d ARN non-codants chez la drosophile

Transcription

1 M2 Génétique - Paris 6 Génétique des Caractères Complexes 15 novembre 2007 (2h) Biogenèse et mécanismes d action d des petits ARN non-codants chez la drosophile Christophe ANTONIEWSKI antoniew@pasteur.fr

2 Découverte de l interférence par l ARN

3 Interférence par l ARNl transfection feeding Viruses Injection ARN double-brin Exogenous Post Trancriptional Gene Silencing (dégradation de l ARNm de séquence homologue) Endogenous Inverted-repeat transcription Homology dependent Cosuppression

4 1ère partie: sirna (small interfering RNA) Cyc dsrna* Luc dsrna* Dicer Immunoprecipitation S2 Extract Bernstein et al. Nature (2001) 409: 363 Elbashir et al. Genes & Development (2001) 15:

5 Caractéristiques des sirna 21 nucléotides double-brin 2 nucléotides débordants en 3 (OH) Activité RNAi per se Activité séquence-spécifique Ciblent ARN sens et antisens Produits en absence d ARNm cible

6 Le complexe RISC (RNA( Induced Silencing Complex) Williams RW, Rubin GM PNAS 2002 Argonautes Deux groupes de protéines selon la présence d aa conservés Nterm: AGO-1, AGO-2 : ubiquitaires Piwi, Aubergine, AGO-3: gonades

7

8 RNA Induced Silencing Complex RISC Helicase? (Armitage/sde3) mrna degradation Cleavage and release of the "passenger" strand

9 Asymétrie thermodynamique/fonctionnelle des sirna Schwarz et al Cell 2004

10 RNA Induced Silencing Complex RISC Helicase? (Armitage/sde3) mrna degradation ΔG ΔG R2D2 se fixe à l'extrémité la + stable Recrutant Dcr à l'extrémité la - stable R2D2 "reconnaît" le 5'P du brin "passager" Cleavage and release of the "passenger" strand

11 2ème partie: : les microrna Lin14, lin28 Lin41, hbl1 let7 CDS 3 UTR

12 Structure des gènes des mirnas mirna autonomes mirna "passagers"

13 Pri-miRNA --> Pré-miRNA Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006 Han et al. Cell 125, , June 2, 2006

14 Biogenèse des mirna 1 ΔG Biais 5 U5 RISC Mais quelle Argonaute?

15 «specialized» mirna and sirna pathways in Drosophila

16 Répression traductionnelle Vs clivage Dégénérescence: le «seed» Doench et al G&D 2004 Saxena et al JBC 2003 Stark et al Plos Biol 2004

17 Le «seed» Dur de trouver une cible de mirna!

18 Les mirna agissent aussi en destabilisant les mrna cibles 174 gènes réprimés (Niveau ARN) mir124 fortement exprimé dans le cerveau Transfection de mir 124 dans des cellules Hela Lim et al. (2005) NATURE VOL 433, p770 Ces gènes sont naturellement moins exprimés dans le cerveau que dans les autres tissus Surexprimer mir124 dans les cellules hela les «pousse» vers une identité neuronale

19 Inhibition: dans les P-bodies

20 Modèle d action d des mirna dans les P-bodies Ago1 GW182 GW182 CCR4:NOT GW182 GW182

21 Ordres de grandeur

22 Fonction des mirnas au cours du développement mir-1 mir-7 Muscle differenciation Eye differenciation mir-1 mir-124 Muscle differenciation Central nervous system differenciation Adapted from He and Hannon, Nature Review Genetics 2004

23 mirna et Cancers They target Bcl2, upregulated in many types of cancers Amplified in B Cell lymphoma mir17 cmyc target + regulates E2F1 Trangenic mice overexpression mir17 harbor c-myc-induced lymphomas Classification of human cancers using mirna profiling Lu et al (2005). Nature 435, 834

24 Mode d action d des mirna dans le contrôle de l expression l génétique Cibles et mirna sont exprimés dans des territoires distincts, mais souvent adjacents (dans l espace ou dans le temps) Repo: exprimé dans cellules gliales Cell 123, , December 16, 2005

25 3ème partie: : les rasirna (pirna) 25 paires de bases Biaisés en 5 : U (80% des cas) Correspondent majoritairemenet à des éléments transposables (transposons et rétrotransposons) surtout abondants dans la lignée germinale (ovaires et testis) Bergman et al. Genome Biology 2006, 7:R112 Aravin et al. Developmental Cell (2003), Vol. 5,

26 Chez la drosophile, les rasirna sont des pirna Co-immunoprécipitation par anti-piwi À partir d extraits d ovaires Clonage/séquençage des petits RNA associés Les rasirna représentent 80% des sirna coprécipités avec un Anti-Piwi Saito et al., Genes and Dev (2006)

27 Les rasirna (pirna) sont majoritairement «antisens» Saito et al., Genes and Dev (2006) Vagin et al., Science (2006) RNA-i «classique» rasirna endogènes majoritairement antisens

28 Dans la lignée germinale, la voie «rasirna» est distincte des voies «mirna» et «sirna» Vagin et al., Science (2006) La voie classique RNA-i est sans effet sur le contrôle des rétroéléments Pas de contrôle par dcr1 sur mdg1, roo et mst40: la voie mirna est également sans effet Les acteurs importants pour le silencing des rétroéléments sont Piwi, Aubergine, armi, et Spn-E (Homeless)

29 «Deep sequencing» Et la lumière fut!

30 Origine génomique des loci producteurs de pirna

31 Biogenèse et mécanisme d action des rasirna (=pirna) chez la drosophile

32 Rôle des petits ARN dans la formation de l'hétérochromatine Chez S. pombe Yamada et al.(2005) Molecular Cell

33 Hétérochromatine péricentromérique chez D. melanogaster pericentromeric repeats GERMLINE Piwi Aub pirna? Ago3 Dicer2 Ago2 sirna? SOMA Su(VAR)3-9 HP1 HP1 HP1 HP1 HP1 HP1 Su(VAR)4-20 HP1 HP1 HP1 - des mutations de Piwi, aub et hls affectent H3K9me et délocalisent la protéine HP1 (Pal-Bhadra et al., (2004) Science).

34 Complexité des voies petits ARN chez la drosophile

35 Bassam Berry Corinne Besnard-Guerin Anne-Laure Bougé Caroline Jacquier Josette Pidoux Delphine Fagegaltier Hélène Thomassin