CM: LES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES HUMAINES: APPARITION, DIAGNOSTIC ET APPROCHES THERAPEUTIQUES

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1 DFGSP2 Module SB2 UE11 : Biologie Moléculaire et Cellulaire Année 2016/2017 CM: LES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES HUMAINES: APPARITION, DIAGNOSTIC ET APPROCHES THERAPEUTIQUES - CHAPITRE IV - APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES (TRANSFERT DE GENE) A- LE CLONAGE MOLECULAIRE D UN ADN D INTERET SUR UN VECTEUR Bernard CARCY Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, EA 4558 «Vaccination antiparasitaire», Faculté de Pharmacie, Université Montpellier

2 I- POLYMORPHISMES DU GENOME HUMAIN ET PATHOLOGIE MOLECULAIRE (MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES) II- MECANISMES ET CONSEQUENCES DES MUTATIONS DELETERES A L ORIGINE DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES III- METHODES D IDENTIFICATION DES MUTATIONS DELETERES A L ORIGINE DES MALADIES GENETIQUES HEREDITAIRES MONOGENIQUES (DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE) IV- APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES (TRANSFERT DE GENE) A- LE CLONAGE MOLECULAIRE D UN ADN D INTERET SUR UN VECTEUR - Extraction des acides nucléiques (ADN, ARNm, synthèse d ADNc) - Séparations électrophorétiques (classique ou PFGE) des Acides Nucléiques (AN) et visualisation - Fragmentation de l'adn - Ligature de 2 ADN (dans une stratégie de clonage d un ADN d intérêt sur un vecteur) - Vecteurs de clonage (plasmides, BAC, rétrovirus) - Transformation bactérienne - Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant ( -complémentation) - Banque d ADN B- APPLICATIONS THERAPEUTIQUES LIEES AU TRANSFERT DE GENE -Production de protéines thérapeutiques recombinantes - par des bactéries en fermenteur (tag (His)6 ou GST) - par des animaux ou végétaux transgéniques - Thérapie génique (ADN médicament) - les différentes stratégies (in vivo ou ex vivo) - les vecteurs viraux - les vecteurs non viraux - Clonage reproductif et thérapeutique - Modifications du génome via approche CRISPR-Cas9

3 TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE II (Appliquées à l extraction, la manipulation et le clonage moléculaire d un gène ou d un génome; transfert de gène ou transgénèse) 2- Fragmentation du génome entier (n fragments d ADN) Amplification d un gène (ou de n gènes) après fragmentation du génome 1- Sélection d un gène d intérêt (1 fragment d ADN) Sous-clonage (changement de vecteur) Sélection Ligature puc AmpR Transformation ADN Vecteur Cellule hôte 2- Clonage de n fragments d ADN (banque d ADN d un génome) 1- Clonage d un seul fragment d ADN (gène)

4 TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE II (Appliquées à l extraction, la manipulation et le clonage moléculaire d un gène ou d un génome; transfert de gène ou transgénèse) Extraction des Acides nucléiques (ADN, ARNm, synthèse d ADNc) Séparation électrophorétique (classique ou PFGE) des acides nucléiques et visualisation Fragmentation de l ADN (enzymatique par ER ou mécanique par shotgun) Ligature de 2 ADN (dans une stratégie de clonage d un ADN sur un vecteur) Vecteurs de clonage (plasmide, BAC, rétrovirus) Transformation bactérienne Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant ( -complémentation) Banques d ADN

5 1- Extraction des Acides nucléiques *Quelques généralités (ADNg ou ADNc, ARNm) ADNg (gène dans un génome eucaryote: intron + exon +5 NC et 3 NC) introns 5 3 exon1 exon2 exon3 exon1 exon2 exon3 3 5 Brin codant Brin non codant ARNm mature : -1 seul cadre de lecture ouvert (Open Reading Frame=ORF) Nter protéine 5 CAP Traduction Transcription/maturation AUG exon1 exon2 exon3 Cter Rétrotranscription Traduction Stop Poly(A) ATG 3 Stop exon1 exon2 exon3 exon1 exon2 exon3 ADNc (ADN complémentaire) copie ADN double brin issue d un ARNm mature)

6 1- Extraction des Acides nucléiques * Principe général d'extraction des acides nucléiques (ADN et ARN) N ADN (µg) Tampon de dissociation des protéines (détergents) Cellule nucléée 1 ARN totaux (µg) + Inhibiteurs RNases endogènes Extraction des AN (Ex: phénol) 2 Précipitation des AN (Ex: Alcool + sel) 3 1 DO260nm = 50µg/ml ADNdb Dosage/Pureté/intégrité des AN (spectro.) 4 1,8 < DO260nm < 2 DO280nm Pureté 1 DO260nm = 40µg/ml ARNsb

7 1- Extraction des Acides nucléiques *Extraction/Purification des ARNm Purification des ARNm sur colonne d affinité (via une séquence oligodt) ARNt ARN totaux purifiés 1 ARNr 5 (A) n 3 ARNm 2 Hybridation des ARNm Par séquences poly(a) n Elution des ARNm 3 Colonne de billes couplées à séquences polydt = (dt) n (dt) n Tampon de force ionique ELEVEE (dt) n (A) n (dt) n (A) n (dt) n (A) n Tampon de force ionique FAIBLE 5 (A) n 3 ARNm ARNm purifiés

8 1- Extraction des Acides nucléiques *Synthèse d'adnc Ex: Synthèse d ADN par la technique de cassure à la Rnase H 5 AAAA-3 1 polyt(18) Hybridation 5 AAAA-3 TTTT-5 Transcriptase dntp 2 reverse Rétrotranscription 5 AAAA-3 3 TTTT-5 RNase H 3 Cassure ARNm 5 AAAA-3 3 TTTT-5 (A)n3 5 ARNm purifié ARNm/ADNc ADN dntp 4 Polymerase 5 AAAA-3 3 TTTT-5 Polymérisation ADN ADNc copie entière

9 2- Séparation électrophorétique des Acides nucléiques (AN) et visualisation *Quelques généralités: -- Migration dans un champ électrique du pôle vers le pôle + (l ADN est chargé en raison des groupements phosphates) - dans un seul champ électrique si fragments < 20kpb (migration dans une seule direction) - dans plusieurs champs électriques d orientation variable (champs pulsé) si fragments >20kbp (ex: migration bidirectionnelle en zig-zag) - Séparation des fragments en fonction de leur taille: - le plus souvent dans un gel d agarose (gel horizontal de 0,6 à 2%) selon la taille des fragments à séparer ou à visualiser (Ex: Southern blot, analyse de fragments PCR) - dans l acrylamide si petits fragments (<100pb) ou si besoin d être très résolutif dans la séparation de fragments (Ex: séquençage de l ADN; détection de mutation par méthodes dérivées de la PCR) - La coloration des AN s effectue par ajout de bromure d éthidium (BET qui est un intercalant de l ADN; toxique) et leur visualisation sous les U.V.

10 2- Séparation électrophorétique des Acides nucléiques (AN) et visualisation *Electrophorèses classique (ADN ou ARN) ou en champ pulsé (ADN) 1 orientation de migration Electrophorèse classique Electrophorèse en Champ pulsé puits de dépôt de l échantillon d ADN à analyser Fragment d ADN 2 orientations de migration Gel 1% d agarose

11 2- Séparation électrophorétique des Acides nucléiques (AN) et visualisation *Séparation électrophorétique d ARN totaux ARNm Contrôle de la qualité de l extraction des ARN totaux d un tissu (en vue d une purification des ARNm) par visualisation de l intégrité des ARN 28S et 18S.

12 2- Séparation électrophorétique des Acides nucléiques (AN) et visualisation *Séparation électrophorétique de fragments d'adn issus d'une fragmentation du génome par une enzyme de restriction (ER) - Étalons de PM Génome digéré par différentes ER + Fragmentation d un génome par des enzymes de restriction (Ex: Southern blot) ADN génomique purifié Digestion par une ER E Le gel d agarose permet d analyser la fragmentation de génomes entiers par des enzymes de restriction (ER) dans la perspective: -d identifier un gène dans un génome et d étudier son organisation génomique (simple copie, multicopie) par hybridation moléculaire (Southern blot) E E E E E E E

13 3- Fragmentation de l ADN *Méthodes de fragmentation de l'adn ADN génomique purifié La plupart des génomes sont beaucoup trop grands (>10 9 pb) pour être analysés en un seul morceau. Il faut les fragmenter COUPURE MECANIQUE (coupure aléatoire = shotgun) COUPURE ENZYMATIQUE PAR LES ENZYMES DE RESTRICTION (coupure à des sites définis) E E E E E E E E

14 3- Fragmentation de l ADN *Les enzymes de restriction de type II => Quelques généralités sur les ER: définition : Endonucléases d origine procaryotique coupant de manière définie et reproductible l ADN double brin quelle que soit son origine. Action: Réduisent de manière reproductible un génome entier à une série de fragments caractéristiques d un ADN donné. ER de type II : une fois la séquence reconnue, l enzyme coupe l ADN double brin au niveau du site de reconnaissance. Il en existe des centaines (commercialisées). nomenclature des ER de type II: Genre Souche Escherichia coli Ry13 Espèce EcoRI (première découverte) EcoRV (cinquième)

15 3- Fragmentation de l ADN *Les enzymes de restriction de type II => les sites de reconnaissance des ER de type II: - séquences courtes (entre 4 et 8 pb) - séquences palindromiques: 5 -GAATTC-3 3 -CTTAAG-5 EcoRI 5 -GGCC-3 3 -CCGG-5 HaeIII - les flèches indiquent le site de coupure sur les 2 brins - la spécificité de reconnaissance des séquences est le plus souvent absolue mais pas toujours: NspIV 5 -GGNCC-3 3 -CCNGG-5 N signifie A,C,G ou T

16 3- Fragmentation de l ADN *Les enzymes de restriction de type II => Analyse de la méthylation de l'adn par des isoschizomères : quand une base peut être méthylée par une méthylase bactérienne, elle est repérée par une astérisque: 5 -CC GG-3 3 -GG CC-5 HpaII -des isoschizomères sont 2 enzymes de restrictions qui reconnaissent une même séquence mais une des enzyme est sensible à la méthylation (ne coupe pas si méthylée). L autre enzyme coupe l ADN qu il soit méthylé ou pas. 5 -CCGG-3 3 -GGCC-5 HpaII et MspI

17 3- Fragmentation de l ADN *Les enzymes de restriction de type II => Les différents types de coupure des ER de type II: - Libération d extrémités franches (blunt or flush ends): HaeIII 5 -GGCC-3 3 -CCGG-5 5 -GG 3 -CC + CC-3 GG-5 - Libération d extrémités cohésives (décalées ou protrusives): - 3 cohésives: - 5 cohésives: EcoRI 5 -GAATTC-3 3 -CTTAAG-5 PvuII 5 -CGATCG-3 3 -GCTAGC G 3 -CTTAA AATTC-3 G-5 5 -CGAT 3 -GC + CG-3 TAGC-5

18 4- Ligature de 2 ADNs différents (dans une stratégie de clonage d un ADN sur un vecteur) *les 2 ADN sont coupés par une même ER 1 2

19 4- Ligature de 2 ADNs différents (dans une stratégie de clonage d un ADN sur un vecteur) *les 2 ADN sont coupés par une même ER ADN LIGASE: enzyme qui assure la formation d une liaison phosphodiester entre une extrémité 3 OH et 5 P de 2 désoxyribonucléotides => Après ligature, l ADN1 se retrouve entre 2 sites de restriction reconstitués par complémentarité des extrémités

20 4- Ligature de 2 ADNs différents (dans une stratégie de clonage d un ADN sur un vecteur) *L efficacité de ligature d un ADN sur un vecteur n est jamais de 100% ori puc AmpR SCM= Site de clonage de l ADNc -Digestion du plasmide par ER - Déphosphorylation des extrémités (phosphatase alcaline) -ligature de l ADNc au vecteur par ADN ligase ER Vecteur recombinant (R) ori puc AmpR ER ET ori puc AmpR Vecteur non recombinant (NR) => tout clonage nécessitera un système de discrimination (= sélection)

21 4--Ligature de de 2 ADNs différents (dans une stratégie de de clonage d un clonage ADN d un sur un ADN vecteur) sur un vecteur) 1- ligature de 2 ADN coupés par la même ER : - que les extémités libérées soient franches ou cohésives, on pourra toujours ligaturer ces 2 ADN (avantage). - on reconstitue le site de restriction initial sur la molécule chimère (avantage) : => donc possibilité de le ressortir du vecteur1 pour le ligaturer sur un autre vecteur (sous-clonage) - L ADN cloné sur le vecteur se retrouve entre 2 sites de restriction identiques : => l'adn peut être cloné dans 2 orientations (inconvénient si objectif est de produire une protéine recombinante) 2- ligature de 2 ADN coupés par des ER différentes: => si coupures franches: - on pourra toujours ligaturer les 2 ADN - Cependant on ne reconstitue pas les sites de restriction initiaux sur la molécule chimère (inconvénient). => Si coupures cohésives : - on ne pourra ligaturer ces 2 ADN que si 1 des 2 sites est contenu dans l autre, par complémentarité des désoxyribonucléotides dans la région simple brin. (inconvénient).

22 5- Vecteurs de clonage *Généralités Définition : c est un système qui permet le transfert, l expression et la réplication d un ADN étranger dans des cellules-hôtes (en vue d un clonage d ADN, d une transgénèse, d une thérapie génique, d un séquençage, etc ). Choix du vecteur de clonage: Le choix d un vecteur pour une opération de clonage dépendra de l ADN étranger à insérer (compatibilité de taille et d extrémités) et de l application (cartograghie et séquençage de génome, expression de protéine thérapeutique dans une bactérie, thérapie génique, ) Quelques vecteurs de clonage: (*) Les vecteurs dont on parlera en DFGSP2, notamment les plasmides

23 5- Vecteurs de clonage *Généralités Propriétés générales des vecteurs de clonage -Réplication autonome (ori), le plus stable possible et sa présence ne doit pas perturber la cellule hôte -présence de marqueurs de sélection (gène de résistance aux antibiotique, gène lacz, ) qui permettront de différencier des bactéries porteuses d un vecteur recombinant ou non recombinant (par colorimétrie ou sur antibiotique). -doit posséder un SCM (site de clonage multiple) constitué d une succession de site unique de coupure par des enzymes de restriction. Ce SCM est l endroit où l ADN à cloner sera inséré. Le SCM est localisé dans un marqueur de sélection. -doit être facilement isolable sous forme pure et en quantité illimitée - le plus petit possible (favorise insertion d ADN plus grands, manipulation plus facile, augmente le nombre de copie par cellule car plus facile à répliquer)

24 5- Vecteurs de clonage *Les plasmides Caracéristiques générales - ADN double brin extrachromosomique -d origine procaryotique - existe naturellement dans les bactéries (= 1 ère génération) - il en existe maintenant de nombreux artifiels (2ème et 3ème génération) Cliché D. Dressier Couramment utilisés dans les stratégies de clonage simple (en vue de production de protéine recombinantes, pour le séquençage d'un gène, pour la sélection d'un gène dans une banque d'adn, etc)

25 5- Vecteurs de clonage *Les plasmides Exemple d un plasmide artificiel de 3 ème génération Caractéristiques majeuresdu plasmide pbluescript: 1-1- Présence d un site de clonage multiple (SCM = MCS ou polylinker) 3 4 lacza Présence de promoteurs (T3 ou T7 ou SP6, ) de part et d autre du SCM - Présence de marqueurs de sélection: -Présence d un gène 3 de résistance à un antibiotique -Présence du gène lacza (peptide de 4 la galactosidase) => couramment utilisé pour la sélection colorimétrique de vecteurs recombinants (Cf TP BioMol1)

26 5- Vecteurs de clonage *Les plasmides Le SCM: 1 1 lacza SCM - Succession de site de restriction unique - nombre et séquence des sites de restriction variable d un plasmide à l autre - plus il contient de site de restriction et plus il sera facile de cloner n importe quel ADN -Le SMC est inséré dans un marqueur de sélection C est l endroit où on ouvre le vecteur par une enzyme de restriction pour y cloner 1 ADN étranger (d extrémités et de taille compatibles)

27 5- Vecteurs de clonage *Les plasmides Les séquences promotrices => localisation des séquences promotrices de part et d autre du SCM (donc de l'insert) => serviront de régions d'hybridation d'amorces (PCR, séquençage, production d'arnm à grande échelle) Faciliteront l analyse des vecteurs recombinants et de l'adn cloné (insert)

28 5- Vecteurs de clonage *Les plasmides Les marqueurs de sélection: (Ex: pbluescript ; Cf TP1 BioMol) 3 4 gène de résistance à un antibiotique 3 4 -gène lacza (peptide de la -galactosidase) Elimination des bactéries non transformées Discrimination colorimétrique des bactéries transformées (via mécanisme d -complémentation) contenant soit : - un plasmide recombinant (blanche) - Un plasmide non recombinant (bleue) Serviront à la sélection des bactéries recombinantes d intérêt (avec vecteur recombinant portant le gène d intérêt cloné)

29 6- La transformation bactérienne *Généralités Objectif : Consiste à faire entrer le plasmide recombinant (porteur du gène d intérêt) dans une cellule hôte (bactérie le plus souvent car simple d'utilisation) où il pourra se répliquer (en grande quantité et sera clonal) => Ce n'est pas un phénomène naturel donc : - on devra fragiliser la paroi bactérienne pour faciliter l'entrée du plasmide (= bactéries compétentes) - on utilisera des méthodes physico-chimiques (choc thermique de 0->42 C, choc électrique=électroporation) pour faire entrer l'adn plasmidique => L' efficacité de la ligature ADN/plasmide n'étant pas de 100 %, on n'aura également pas d'efficacité de transformation de vecteur recombinant de 100 % (des bactéries ne seront pas transformées et parmi les bactéries transformées on aura des bactéries transformées par un vecteur non recombinant et d'autres par un vecteur recombinant). => Il faudra donc un système de sélection double capable de discriminer à la fois : - les bactéries transformées des bactéries non transformées (via gène de résistance à un antibiotique) - les bactéries transformées par un vecteur recombinant ou non recombinant (via du gène lacza)

30 6- La transformation bactérienne * Préparation de Bactéries compétentes Bactéries (Escherichia coli) Paroi bactérienne intacte ADN bactérien paroi fragilisée (par CaCl2 par exemple) pour faciliter l entrée du vecteur Bactéries compétentes => Bactéries aptes à recevoir de l ADN étranger Paroi bactérienne fragilisée

31 6- La transformation bactérienne * Transformation des bactéries compétentes Bactéries compétentes (Escherichia coli) Résultat de la ligature ADN/vecteur Méthodes physico-chimiques: Choc thermique (0=>42 C) ou électrique (électroporation) (L efficacité de ligature d un ADN sur un vecteur n est jamais de 100%) Bactéries transformées Recombinantes à sélectionner Bactéries transformées Bactéries non transformées => L efficacité de la transformation n est jamais de 100%

32 7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant ( -complémentation) * L'opéron lactose bactérien (Cf Cours Bactériologie) Biologie et Multimédia - Université Pierre et Marie Curie

33 7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant ( -complémentation) * L'opéron lactose bactérien (Cf Cours Bactériologie)

34 7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant ( -complémentation) *Le mécanisme d' -complémentation - dans OPERON LACTOSE BACTERIEN : gène lacz -galactosidase Enzy + (substrat: lactose) - LORS OPERATION CLONAGE MOLECULAIRE: -Gène lacz présent sur un vecteur -Gène lacz présent sur le génome bactérien lac- des bactéries à transformer: Peptide Enzy - Peptide Enzy - -complémentation Enzy + (substrat: X-gal) On restaure l activité enzymatique lors d une association (-> par contre l activité enzymatique ne sera pas restaurée si modifié par insertion d un gène dans lacz (=> plus d association

35 7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant ( -complémentation) *Le mécanisme d' -complémentation => par contre l activité enzymatique n est pas restaurée si modifié par insertion d un gène (plus d association PAS de -galactosidase (Enzy-) Transformation bactérienne (en présence X-gal/IPTG/Ampicilline) association => -galactosidase AVEC activité enzymatique (Enzy+) A sélectionner PAS d'association Rec => PAS de -galactosidase donc => PAS d'activité enzymatique (Enzy-)

36 7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant ( -complémentation) *Phénotypes bactériens en présence d'x-gal/iptg/ampicilline Blanche (Enzy-), AmpS Bleue (Enzy+), AmpR 3 phénotypes distincts DONC REC différentiable des deux autres types Blanche (Enzy-), AmpR A sélectionner

37 7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant ( -complémentation) *Rôle de l'x-gal (en présence d'iptg) => C'est le SUBSTRAT (incolore) de la -galactosidase dans ce système de sélection X-gal (5-Bromo 4-chloro 3-indolyl bd galactopyranoside) (SUBSTRAT incolore) Association PAS d'association Rec -galactosidase NORMALE Protéine codée par l ADNc Peptide Rec Peptide Bromo-chloro-indol (BLEU) Colonies bactériennes BLEUES ( -complémentation) Colonies bactériennes BLANCHES (PAS d -complémentation)

38 7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant ( -complémentation) *Rôle de l'iptg (Isopropyl D thyogalactopyranoside) => analogue non métabolisable du lactose qui induiera la synthèse du peptide ou Rec Cas 1: Absence d IPTG TRANSCRIPTION/TRADUCTION BLOQUEE Cas 2: présence d IPTG TRANSCRIPTION/TRADUCTION OUVERTE

39 7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant ( -complémentation) *Sélection d un clone à analyser: Colonie bactérienne blanche : n bactéries transformées par le même vecteur recombinant Culture sur boite de pétri LB+Ampicilline + IPTG et X-gal Analyse de l insert Prélèvement et Multiplication en culture liquide + Ampi Extraction du plasmide (miniprep)

40 7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant ( -complémentation) *Succès du clonage (nombre de clones à obtenir): 1- Clonage d un fragment d ADN unique 2- Banque (clonage de n fragments d ADN) Tous les clones blancs contiennent le même insert Les clones blancs 1, 2, 4, 6 et 7 peuvent contenir des inserts différents CLONE BLANC SUFFIT > 95% BLANCS

41 8- Banques d ADN *Généralités Une banque d ADN (library) : correspond à un ensemble de clones cellulaires (bactéries, levures, ) où chaque cellule renferme un exemplaire différent d ADN recombiné à un vecteur. La construction d une banque : dépendra de ce que l on recherche - ADN génomique - exons, introns, séquences régulatrices des gènes - tout type cellulaire (exception : cellules de l immunité) - ADNc (complémentaire) - exons des gènes - il existe une spécificité tissulaire => Une banque d ADN contiendra donc, sous forme morcelée, l ensemble de l information génétique (ADNg ou ARNm matures via ADNc) d un individu telle qu elle existe dans son génome.

42 8- Banques d ADN *Exemple de construction d'une banque d'expression plasmidique Ex: ADNc1 ADNc2 ADNc3 ADNc4 ADNc5 ADNcn Clonage dans vecteur plasmidique au niveau de lacz puc puc puc puc puc puc AmpR Transformation bactérienne n BACTERIES RECOMBINANTES CONTENANT UN SEUL PLASMIDE RECOMBINANT

43 8- Banques d ADN *Stockage des clones d'une banque Clones bactériens Sur boite de pétri Exemple : Banque de 1536 clones bactériens (16 plaques de 96 puits (ou 4 plaques de 384 puits) Clones bactériens Sur plaques 96puits (ou 384 puits) ADN plasmidiques extraits des Clones bactériens sur plaques 96puits (ou 384 puits) Exemple : Stockage des 1536 ADN plasmidiques extraits des 1536 clones bactériens d'une banque sur un filtre de Nylon (chaque clone est déposé en duplica)

44 8- Banques d ADN *Criblage des clones d'une banque => Consiste en la sélection d'un clone parmi un ensemble de clones que constitue la banque Criblage par PCR à l'aide d'un couple D'amorces spécifiques d'un gène: 20 réactions PCR permettent l analyse de 96 clones 12 Réactions PCR sur des mélanges de colonnes (8 clones/colonne) ABCDEFGH 8 Réactions PCR sur des mélanges de lignes (12 clones/ligne) => Clone positif en position F4 sur la plaque 96 puits

45 8- Banques d ADN *Criblage des clones d'une banque Criblage par PCR:

46 8- Banques d ADN *Criblage des clones d'une banque Criblage par PCR (localisation de 2 gènes dans la banque):

47 8- Banques d ADN *Criblage des clones d'une banque Criblage par hybridation moléculaire À l'aide d'une sonde Exemple : Banque de 1536 ADN plasmidiques extraits des 1536 clones bactériens d'une banque sur un filtre de Nylon (chaque clone est déposé en duplica) hybridation avec une sonde Résultat : donne la localisation du gène étudié dans la banque d'adn

48 8- Banques d ADN *Criblage des clones d'une banque Criblage par hybridation moléculaire À l'aide de plusieurs sondes distinctes Sonde 1 Exemple : Banque de 1536 ADN plasmidiques extraits des 1536 clones bactériens d'une banque sur un filtre de Nylon (chaque clone est déposé en duplica) Sonde 2 Résultats : Les gènes 1 et 2 sont localisés dans les mêmes régions génomiques (organisation génomique en tandem)

49 8- Banques d ADN * Déchiffrage d'un génome entier par séquençage => les fragments d'adn séquencés constituent des banques d'adn (de grands (vecteur de type BAC) ou petits (vecteur de type Plasmide) fragments)

50 8- Banques d ADN * Déchiffrage d'un génome entier par séquençage => les fragments d'adn séquencés constituent des banques d'adn (de grands (vecteur de type BAC) ou petits (vecteur de type Plasmide) fragments)

51 8- Banques d ADN * Déchiffrage d'un génome entier par séquençage Quelques objectifs d'analyse de Diversité chez les individus d'une même espèce - identifier les mutations impliquées dans maladies (entre autre) - étudier la relation facteurs environnementaux, gènes et maladies - mise au point de kits génétiques pour le grand public («médecine» prédictive ou personnalisée)

52 I- POLYMORPHISMES DU GENOME HUMAIN ET PATHOLOGIE MOLECULAIRE (MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES) II- MECANISMES ET CONSEQUENCES DES MUTATIONS DELETERES A L ORIGINE DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES III- METHODES D IDENTIFICATION DES MUTATIONS DELETERES A L ORIGINE DES MALADIES GENETIQUES HEREDITAIRES MONOGENIQUES (DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE) IV- APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES (TRANSFERT DE GENE) A- LE CLONAGE MOLECULAIRE D UN ADN D INTERET SUR UN VECTEUR - Extraction des acides nucléiques (ADN, ARNm, synthèse d ADNc) - Séparations électrophorétiques (classique ou PFGE) de l ADN et visualisation - Ligature de 2 ADN (dans une stratégie de clonage d un ADN d intérêt sur un vecteur) - Vecteurs de clonage (plasmides, BAC, rétrovirus) - Transformation bactérienne - Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant ( -complémentation) - Banque d ADN B- APPLICATIONS THERAPEUTIQUES LIEES AU TRANSFERT DE GENE - Production de protéines thérapeutiques recombinantes - par des bactéries en fermenteur (tag (His)6 ou GST) - par des animaux ou végétaux transgéniques - Thérapie génique (ADN médicament) - les différentes stratégies (in vivo ou ex vivo) - les vecteurs viraux - les vecteurs non viraux -Clonage reproductif et thérapeutique - Modifications du génome via approche CRISPR-Cas9