Sarcome indifférencié

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1 Cytogénétique classique peu informative, et délicate à mettre en œuvre pour la plupart des tumeurs solides n = 54 n = 97 Sarcome indifférencié

2 Sarcome indifférencié

3 Cancer du sein

4 Cytogénétique 24 couleurs et FISH informatives pour les remaniements, mais renseignent peu sur les gains et pertes de chromosomes

5 La connaissance des gains et et pertes de segments chromosomiques est capitale pour comprendre les processus d oncogénèse, car de façon générale: La La perte de de fonction d un gène suppresseur de de tumeurs est est associée à la la perte du du segment chromosomique où où est est localisé ce ce gène Le Le gain de de fonction d un oncogène est est associé au au gain ou ou à l amplification du du segment chromosomique correspondant

6 gain Principe de la CGH Hybridation Génomique Comparative ADN tumoral marqué en FITC ADN normal marqué en Rhodamine Dénaturation et hybridation sur chromosomes normaux perte Excès d ADN tumoral Amplification Défaut d ADN tumoral Délétion Microscopie à fluorescence et Analyse d images

7 perte gain Résolution: 10-20Mb

8 Représentation classique des données Résolution: 10-20Mb X

9 Nécessité d une deuxième étape d allélotypage homozygote homozygote contaminé par des cellules normales hétérozygote RB1 est inactivé dans 80% des MFH (Histiocytofibromes malins) contamination

10 100 Malignant Fibrous Histiocytomas Very high level amplification High level amplification Simple gain Loss Normal 1p32 6q23 12q14-q15 1q Rétropéritonéal LPSD? LMSD? Ces anomalies peuvent être classées par des logiciels de clustering adaptés 13

11 Principal Component Analysis

12 DFS: 100% LMS: 57% LPSD 76% MFH: 62% Survies à 5 ans sans métastase WDLPS: 100% GIST: 10%

13 Principe de la CGH ARRAY Hybridation Génomique Comparative ADN tumoral marqué en CY5 ADN normal marqué en CY3 Dénaturation et hybridation sur BAC / PAC 500m SCANNER LASER et Analyse d images Excès d ADN tumoral Amplification Défaut d ADN tumoral Délétion

14 PLUSIEURS NIVEAUX DE RESOLUTION ENVISAGEABLES Faible résolution pangénome ( 8Mb) Résolution équivalente à CGH classique puce 400 locus ( 1 clone par bande+télomères) Haute résolution pangénome (1Mb) puce 3450 locus (=10 clones par bande) Haute résolution régionale ( 500kb) puce 1p: 400 locus Très haute résolution ( contigs) puce dédiée amplicons: 200 locus

15 CHOIX DES CLONES 12q14.1 CDK4

16 SPOTTEUR POINTES SCANNER

17

18 PUCE PANGENOME (3300 locus, dont 400 «gènes de cancer» : oncogènes, suppresseurs, cyclines, etc ) déposés en triplicats

19 Préparation de la cible Amplification de la Biobanque Maxi-Prep MDA Marquage par Ramdom Priming Ex: ADN Tumoral-Cy5 ADN Normal-Cy3 Préparation de la sonde Spotting MicroGrid TAS Analyse des Résultats Macros /Amadea Hybridation (Corning) Quantification de l'image GenePix Pro 4.0 Le process général Détection et acquisition Scan Array 5000

20 L'Analyse - Un bon scanning est indispensable, et correspond à une prénormalisation des signaux (à remarquer le léger décalage R/V, à corriger en Genepix) La pente du scatter plot en Genepix sera indicative de cet équilibre des deux Cy

21 Appréciation de la qualité de l expérience et de l analyse Analyse du scatter plot Genepix Correct Déséquilibre des fluorescences Bruit de fond + déséquilibre

22 Néanmoins, une belle manip de tumeur contaminée aura une dynamique faible. Contamination croissante A partir de 40% de contamination, seuls les amplicons restent réellement interprétables

23 Il en sera de même si les aneusomies sont en mosaïque: Petit décalage de l ensemble du chromosome 3 (retrouvé en CGH) ---> probablement nécessité de fixer arbitrairement les seuils de gains et pertes pour chaque tumeur, ou d augmenter artificiellement la dynamique, en particulier si l on souhaite clusteriser

24

25

26 2 12 X 19

27 Gain évident de résolution Non vu en CGH A peine suspecté A peine suspecté Non vu en CGH Chr 1 Chr 2 Chr 3 Chr 7

28 Interface Graphique Equipe Emmanuel Barillot: P. La Rosa, S Liva

29 Etape suivante: zoom avec puce dédiée

30 L amplification du 6q est associée à l indifférenciation et à l agressivité tumorale

31 PUCE DEDIEE AUX AMPLICONS DES SARCOMES

32 G 11 E4 L3 K11 A21 N8 O2 F20 M11 P17 B7 J18 F17 O6 L3 M24 A5 D8 N15 C8 E11 B5 G12 M15 L1 L8 F20 A BAC/PAC TUMEUR N CDK4 MDM2 10mm x 2,5 mm 12q14-15

33 C 8 D 5 O 18 N 20 F 20 N 7 J 4 O 4 C 16 L 8 I 14 F 23 A 1 J 4 G 10 D 12 H 19 H 2 D 17 C 9 C 18 M 11 A 20 E 21 A 4 L 18 K 8 G 5 P 22 F 17 A 10 P 15 K 17 E12 F 10 F 11 M 20 A 13 6q23 ASK1

34

35 Sarcome indifférencié Gène surexprimé dans l amplicon Extinction du gène candidat surexprimé ASK1 as a potential therapeutic target in undifferentiated liposarcoma Chibon et al, Genes Chromosomes Cancer 2004 (sous presse)

36 La puce souris Elle bénéficie des mêmes structures de préparation, de base de données, des mêmes macros d analyse, mais a en outre la possibilité d afficher aussi des résultats «humanisés» des tumeurs murines. Profil CGH murin HCC N 19 Profil CGH "humanisé" M.H. Stern

37 Les précurseurs Frédéric Chibon (thèse) Martine Peter (Curie) Odette Mariani (thèse) Nicolas Sévenet (Curie) Gaëlle Mauger (LNCC) Le développement Pangénomique Souris Carine Ganem-Elbaz (LNCC) Axel Mazoyer (LNCC) Marc-Henri Stern (INSERM) Les partenaires C.I.T Gabor Gyapay (CNS) Equipe Philippe Dessen (CIT3) Peter Brooks (Integragen) Philippe Gesnouin (Integragen) Le développement Pangénomique Humaine Gaëlle Pierron (Curie) Elodie Manié (LNCC) Caroline Brennetot (INSERM) Nadège Gruel (Curie) Isabelle Janoueix (INSERM) Maryline Delattre (LNCC) Bruno Lafont (LNCC) Sandra Autran (LNCC) Delphine Hurrier-Bujon (LNCC) Alain Aurias (INSERM) Olivier Delattre (INSERM) La bioinformatique Stéphane Liva, Philippe La Rosa et l équipe d E. Barillot (Curie)

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