LES CAPSIDES RECOMBINANTES DE DENSOVIRUS COMME PLATE FORME POUR LA PRÉSENTATION D'UN ÉPITOPE DU VIRUS RESPIRATOIRE SYNCYTIAL HUMAIN
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- Joseph Corentin Desjardins
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1 Université du Québec INRS-INSTITUT ARMAND-FRAPPIER LES CAPSIDES RECOMBINANTES DE DENSOVIRUS COMME PLATE FORME POUR LA PRÉSENTATION D'UN ÉPITOPE DU VIRUS RESPIRATOIRE SYNCYTIAL HUMAIN Par MAUD DAVID Mémoire présenté pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M. Sc.) en virologie Septembre 2001 Jury d'évaluation Examinateur externe Examinateur interne Directeur de recherche Codirecteur de recherche Dr. Denis Leclerc Centre de Recherche en Infectiologie CHUQ, Pav. CHUL, Université Laval Dr. Suzanne Lemieux Santé humaine Dr. Peter Tijssen Microbiologie et bioteclmologie Dr. Michel Trudel Santé humaine droits réservés de Maud David, 2001
2 De nos Jours, la plupart des vaccms utilisés sont encore faits de virus vivants ou inactivés. Des atténuations insuffisantes ou des inactivations incomplètes constituent toujours un risque pour la santé des êtres humains ou des animaux. De récentes stratégies ont procuré de nouvelles approches pour créer des vaccins sécuritaires. Depuis quelques années, les baculovirus retiennent l'attention quant à leur capacité d'exprimer de grandes quantités de protéines mimant la protéine virale authentique. Le densovirus de la larve Galleria mellonella est un petit virus eucaryote non enveloppé avec une capside d'environ 22 mn de diamètre. Son génome est fait d'adn monocaténaire linéaire ambisens de 6 kb. L'expression du gène VP4 du densovirus GmDNV, codant pour la protéine de capside (VP), dans les cellules d'insectes grâce à l'utilisation du système du baculovirus permet de produire des capsides recombinantes formées par l'auto-assemblage des VP4. Ces capsides recombinantes ont été utilisé pour présenter un épitope protecteur du virus respiratoire syncytial humain (VRSH) au système immunitaire. Le VRSH est l'agent causal le plus important des maladies virales des voies respiratoires inférieures chez les nouveau-nés et les enfants en bas-âge. Malgré 1' importance des infections et des dommages causés par ce virus, il n'existe toujours pas de vaccin sécuritaire et efficace pour la protection des enfants. L'épi tope inséré est constitué des acides aminés de la glycoprotéine de surface virale G qui est un antigène viral majeur. L'épitope a été inséré à un endroit stratégique à la surface de la capside, soit en C-terminal de VP4. Grâce à plusieurs analyses la présence du peptide inséré sur les capsides recombinantes à pu être détectée. Malheureusement, lors de l'évaluation de l'activité protectrice de l'épi tope exprimé à la surface des capsides recombinantes de GmDNV dans un modèle animal aucune réponse immunitaire contre le pathogène VRSH n'a pu être détectée. 7 Étudirulle /kzt?[d Directeur de recherche
3 Remerciements : Je tiens à remercier mon directem de recherche Dr. Peter Tijssen ainsi que mon codirectem Dr. Michel Trudel pom lem suppo11 scientifique tout au long de ma maîtrise. Je voudrais également remercier le Dr. Yi Li pour son aide précieuse dans le laboratoire ainsi que tous les autres membres du laboratoire. Merci à l'institut Annand-Frappier de m'avoir pernùs d'y faire mes études graduées. Je remercie mon père, Charles, et ma mère, Marilyn, pom lem soutien continu. Ma grande sœw Caroline pow son aide et ses conseils ainsi que mon conjoint Bruce pom m'avoir encouragée dans les moments de décomagement. Merci à mes deux petits trésors Antoine et Justine qui me tout toujoms garder le somire.
4 Sommaire
5 iii TABLE DES MATIÈRES TABLE DES MATIÈRES iii LISTE DES TABLEAUX vii LISTE DES FIGURES... viii LISTE DES ABRÉVIATIONS ix INTRODUCTION... 1 REVUE BIBLIOGRAPHIQUE LES GÉNÉRALITÉS Historique Pathologies du GmDNV Caractérisation du G1nDNV CLASSIFICATION DES PARVOVIRUS ET ORGANISATION DU GÉNOME Densovirus Brevidensovirus Iteravirus Bidensovirus SPECTRE D'HÔTE CARACTÉRISTIQUES DU VIRION Propriétés du virion Propriétés biochimiques Propriétés antigéniques BIOLOGIE MOLÉCULAIRE DES DENSOVIRUS Nature du génome Transcription des gènes d'insectes Transcription et traduction des gènes de DNV Réplication des DNV PRODUITS DU GÉNOME Protéines non-structurales Protéines structurales MORPHOLOGIE ET STRUCTURE En général Échange de domaine Les boucles chez le GmDNV Interactions des sous-unités PARTICULES VIRALES RECOMBINANTES VIDES (VLPs) LE VIRUS RESPIRATOIRE SYNCYTIAL HUMAIN (VRSH)... 37
6 iv 9.1 Généralités Les glycoprotéines de surface du VRS La glycoprotéine F La glycoprotéine G Immunité Immunité à médiation cellulaire Immunité humorale O. LES VACCINS Vaccin inactivé Vaccin atténué Vaccin peptidique (sou~-unitaire) MÉTHODOLOGIE MÉTHODE DE CLONAGE La réaction en chaîne en présence de polymérase (PCR) Description du PCR Choix des amorces pour amplification de la VP Composante de la réaction Analyse de l'adn en gel d'agarose Clonage Purification de 1 'ADN Vecteur Digestion Ligation SÉLECTION DES CLONES POSITIFS Transformation d' Escherichia coli Milieux de culture et géloses Méthode rapide UFX (Cormack et Somssich, 1997) Séquençage PRODUCTION DU BACMIDE RECOMBINANT Transformation d' Escherichia coli (DHlOBac) pour la transposition Extraction de l'adn du bacmide recombinant PRODUCTION DU BACULOVIRUS RECOMBINANT Transfection de cellules Sf9 avec l'adn du bacmide recombinant Amplification du baculovirus recombinant Conservation des baculovirus recombinant Titrage du baculovirus recombinant Préparation des plaques Coloration au rouge neutre Calcul du titre EXPRESSION DES PROTÉINES Optimisation de l'expression Expression des protéines en flacon Infection de cellules en suspension dans un fermenteur... 70
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