TP "La prédiction des maladies génétiques"

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1 TP "La prédiction des maladies génétiques" Nous l'avons vu au TP précédent à propos de l'hémophilie A : les connaissances en génétique établies par Morgan permettent de calculer des probabilités avant la naissance d'un individu. Problématiques : - Il faut mener des calculs de probabilités... exerçons nous (partie 1 du TP) - Comment les avancées en génétique qui ont eu lieu depuis Morgan permettent elles d'être plus précis? Partie 1 : Dans les différents cas présentés ci-dessous, évaluer l'intérêt qu'il pourrait y avoir à proposer un diagnostic prénatal. Document 1"L'hémochromatose" C'est une maladie causée par un allèle du gène HFE situé sur le chromosome 6. Elle est très fréquente en Europe du Nord où une personne sur 10 est porteuse de l'allèle "muté". Calculer la probabilité que II-1 et II-5 ait un enfant atteint. Un diagnostic plus précis est-il justifié? III-5 se marie avec une femme saine. Calculer les risque que ce couple ait un enfant malade.

2 Document 2 : la chorée de Huntington : Les personnes qui en sont atteintes présentent, à un âge avancé (vers 50 ans en général) une démence profonde. Calculer le risque que III-2 ait un enfant malade en se mariant avec une personne saine. Proposeriez-vous un diagnostic?

3 Bilan de la partie 1: Partie 2 : Nous allons voir comment des examen mettant en œuvres des techniques du génie génétique, plus modernes, permettent de poser un diagnostic précis. Problématique 1: - Quelles sont les techniques du génie génétiques utilisées pour poser ces diagnostics?quelles connaissances en génétiques soustendent ces techniques? - Comment les enzymes de restriction permettent-elles de diagnostiquer avec précision les maladies génétiques? Doc. "Bilan des connaissances en génétique" Les caractères héréditaires sont gouvernés par les gènes. Gène = (cf. Sujet 4 du TP précédent) fragment d'adn dont la séquence nucléotidique (l'ordre des nucléotides) détermine la séquence des acindes aminés de la protéine correspondante, donc ses propriétés chimiques, donc les caractères dans la réalisation desquels cette protéine intervient. Rappel de seconde : l'adn est un macromolécule formée de nucléotides assemblés pour former deux chaînes complémentaires. Rappel de première : 1- pour passer de l'adn à la protéine, l'adn est d'abord transcrit : l'un des deux brins d'adn, le brin transcrit, est complété par des nucléotides pour former l'arn messager (ARNm). L'ARNm est ensuite traduit : les ribosomes permettent de faire correspondre trois nucléotides consécutifs (un codon) à un acide aminé. Cette "traduction" suit le code génétique (voir fiche distribuée en tronc commun). 2- (voir fiche "La réplication") La réplication est aussi basée sur la complémentarité des bases : la molécule d'adn est "ouverte", puis chaque brin d'adn est complété afin de reformer deux molécules d'adn identiques à la première. La réplication a lieu dans le sens 5'->3' et nécessite l'intervention de nombreuses enzymes, dont l'adn polymérase. 3- Le génome des eucaryote est siuté dans le noyau. Il est constitué de paires de chromosomes homologues (hormis dans les gamètes), chaque chromosome étant constitué d'une molécule d'adn (sauf avant les divisions cellulaires). 4- Le génome des procaryote est fondamentalement différent : chaque bactérie ne possède principalement qu'une molécule d'adn circulaire (on parle de chromosome bactérien) parfois accompagnée d'autres molécules d'adn circulaires de petites tailles : les plasmides. Chaque gène n'est donc généralement présent qu'en un seul exemplaire. Surtout, les bactéries sont capables de s'échanger des plasmides et de les récupérer dans leur milieu!

4 5- Nous le savons : les virus se multiplient en insérant leur génome dans l'adn de leurs cellules-hôtes. Les bactéries ne sont pas sans défense vis-à-vis des virus : elle fabriquent en effet des enzymes, les enzymes de restriction, qui ont la propriété de découper l'adn au niveau de séquences caractéristiques, souvent palyndromiques. Exemples : 6- Les bactéries sont sensibles aux antibiotiques. Documents "Les technologie du génie génétique" Elles sont l'application directe des connaissances en génétiques. Il faut connaître les techniques suivantes : Deux méthodes sont utilisées pour multiplier des fragments d'adn : A- la PCR (Polymer Chain Reaction) (voir fiches) : elle consiste à réaliser consécutivement de nombreuses fois et ex-vivo la réplication du brin d'adn à multiplier. On utilise pour cela exactement les mêmes enzymes que celles de la réplication dans des machines adaptées. B- la réalisation de banques de gènes (voir fiches) : il faut au préalable avoir fabriqué des plasmides dans lesquels on a inséré les fragments d'adn à multiplier (voir 'C- la fabrication de plasmides recombinants'). Il suffit alors de cultiver des bactéries dans un milieu contenant ces plasmides : certaines d'entre-elles vont récupérer des plasmides et les multiplier ensuite à chaque fois qu'elles vont se diviser. En isolant les bactéries qui ont récupéré des plasmides et en les laissant se multiplier, on obtient donc une "banque de gènes", c'est-à-dire une collection de bactéries qui contiendront le (ou les) gène(s) insérés dans des plasmides. C- la fabrication de plasmides recombinants (voir fiches) : elle est basée sur les propriétés des enzymes de restriction, qui jouent le rôle de véritables ciseaux à ADN : l'adn à étudier et des plasmides sont découpés avec la même enzyme de restriction. Mis ensemble en présence d'adn ligase, ils vont aléatoirement se "recoller" par leurs bouts collants. Il faut par contre savoir faire le tri entre les plasmides qui se sont refermés sans avoir intégré d'adn et ceux qui dans lesquels un fragment d'adn à étudier est effectivement inséré. On parle de criblage (voir fiches et sujet 'Nouméa 2008'), basé sur l'utilisation de plasmides contenant deux gènes de résistance à des antibiotiques ou deux gènes permettant la synthèse de molécules fluorescentes. D- l'électrophorèse d'adn sur gel : comme l'électrophorèse de protéines (cf. Western blot), elle permet de séparer des brins d'adn placés dans un champ électrique. Les brins les plus petits migrent le plus loin. E- les sondes à ADN (radioactives ou fluorescentes) : on fabrique des molécules d'arn ou d'adn monocaténaire (=un seul brin) complémentaires de la séquence que dont on veut mettre en évidence la présence et facilement repérables car radiactives ou fluorescentes. Incubées dans des conditions physico-chimiques adéquates, ces sondes vont s'hybrider avec les brins d'adn dont elles sont complémentaires et y rester fixer ensuite (après rinçage). Dans un southern blot, on pourra donc identifier les régions du gel où est localisé l'adn dont les séquences sont complémentaires des sondes. Appliquons ces techniques

5 bac S 2005 Polynésie Partie 2.2 : enseignement de spécialité (5 points) Des débuts de la génétique aux enjeux actuels des biotechnologies L'albinisme correspond à une déficience héréditaire caractérisée par une absence de pigmentation de la peau, des yeux et des poils en raison de l'absence d'un pigment noir, la mélanine. La tyrosinase est une enzyme impliquée dans plusieurs réactions de la chaine de biosynthèse de ce pigment. On connait de nombreux allèles du gène de la tyrosinase (porté par un autosome). Seuls deux allèles sont pris en compte dans cet exercice : l'allèle A conduisant à une tyrosinase active avec synthèse de mélanine, l'allèle B conduisant à une tyrosinase inactive et ne permettant pas la synthèse de mélanine. Exploitez les documents 1 à 3 pour : - indiquer en quoi les enzymes de restriction permettent d'identifier les allèles présents chez les individus testés; - établir un diagnostic génétique de l'albinisme chez l'enfant à naitre (III 1). Document 1: séquence monobrin partielle des deux allèles A et B du gène de la tyrosinase Document 2 Arbre généalogique d'une famille qui présente des cas d'albinisme et résultats de l'électrophorèse des fragments de restriction (enzyme Hae III) d'une portion du gène de la tyrosinase obtenus par la technique du Southern Blot pour quatre membres de la famille. Les fragments de restriction, dont la longueur est exprimée en paires de bases (pb), sont disposés par ordre décroissant dans le sens de migration. Document 3 a. carte de restriction des sites établie avec l'enzyme Hae III dans une portion de l'allèle A du gène de la tyrosinase b. Site de restriction de l'enzyme Hae I c. Technique du Southern Blot On extrait l'adn à partir de cellules des adultes (1-2), (II-1 et 3) ou de cellules prélevées par amniocentèse chez le fœtus (III-1). L'ADN est ensuite traité par l'enzyme de restriction Hae III et les fragments obtenus sont soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose. Après dénaturation de l'adn, on transfère une empreinte (blot) du gel sur un filtre de nitrocellulose (la position des fragments d'adn est respectée au cours de ce transfert). Le filtre est immergé dans une solution contenant une sonde moléculaire radioactive d'adn monobrin reconnaissant une petite zone du gène de la tyrosinase puis, après incubation de quelques heures à 65 C pour permettre la fixation (l'hybridation) de la sonde sur les fragments d'adn complémentaires, le filtre est rincé de façon à éliminer les sondes non fixées (la sonde peut se fixer sur une partie seulement ou sur la totalité de la séquence reconnue). Le filtre est autoradiographié, ce qui révèle l'emplacement de la sonde radioactive et donc des fragments d'adn recherchés qui lui sont complémentaires.

6 Exploitation des documents du sujet "bacs 2005 Polynésie" : On veut savoir quelles si l'enfant à naître possède l'allèle A, "normal", ou l'allèle B, responsable de l'albinisme car ne permettant pas la synthèse de l'enzyme tyrosinase. On réalise pour cela un Southern blot de différents individus de la famille. Voyons ce qu'il advient des allèles A et B lors des différentes étapes du Southern blot (doc. 3c) : - Après extraction (étape 1), l'adn de chaque individu est traité par l'enzyme de restriction HaeIII (étape 2). L'enzyme HaeIII a la propriété de découper l'adn au niveau d'une séquence spécifique : GGCC (doc. 3b). Si cette séquence est présente dans l'adn des individus de la famille, cet ADN sera découpé au niveau de cette séquence. Or (doc. 1), cette séquence apparaît deux fois dans la portion de l'allèle A du gène de la tyrosinase, entre les paires de bases et les paires : ce sont deux sites de restriction de l'enzyme HaeIII. Ce dernier site ( ) n'apparaît pas dans l'allèle B, puisque cet allèle présente à cette emplacement la séquence GGCT et non GGCC (doc.1). Le doc.3a signale la présence d'un deuxième site de restriction sur l'allèle A, après la paire de base 470 (il ne dit pas si ce site est aussi présent sur l'allèle B, on supposera que c'est le cas). Conclusion des étapes 1 et 2 : Site de restriction = Fragment de restriction = - Étape 3 : on sépare les fragments de restriction issu de l'action de HaeIII sur l'adn des individus de la famille en fonction de leurs tailles en réalisant une électrophorèse sur gel. Après l'électrophorèse, les fragements sont situés d'autant plus loins qu'ils sont petits, mais n'apparaissent pas : ils sont incolores. Deux possibilités se présentent alors : soit on utilise un colorant de l'adn : toute région de la bandelette de nitrocellulose où il y a de l'adn sera colorée, soit (c'est la solution retenue ici, étape 4) on utilise une sonde à ADN qui va s'hybrider à certains seulement des fragments de restriction. Ici, la sonde à ADN radiocative s'hybride avec l'allèle A aux alentours de la paire de base 240 (on ne nous donne pas sa longueur exacte). Si l'on suppose qu'elle a une longueur de 20 nucléotides et qu'elle se répartit également de part et d'autre de la paire 240, elle doit avoir la séquence : Conclusion de l'étape 4 :

7 Examinons les autoradiographies obtenu à partir de l'adn des différents individus (doc.2) afin de savoir, en comptant les tâches présentes, quels allèles ils possèdent : Conclusion générale après examen des documents de sujet "bacs 2005 Polynésie" : Southern blot = Problématique 2 : - Que faire si les allèles impliqués dans une maladie présentent les mêmes sites de restriction ou ne présentent pas de sites de restriction? Nous allons l'étudier dans ce sujet (voir page suivante) :

8 (métropole septembre 2005 ; Enseignement de spécialité). 5 points. DES DÉBUTS DE LA GÉNÉTIQUE AUX ENJEUX ACTUELS DES BIOTECHNOLOGIES En confrontant les informations apportées par l'analyse des documents 1 à 3 et vos connaissances, vous expliquerez : - que la seule analyse de l'arbre généalogique ne permet pas un diagnostic sûr concernant l'embryon porté par la femme III8 ; DÉJÀ FAIT, À NE PAS REFAIRE - que les tests génétiques réalisés permettent de lever les doutes relatifs à l'hémophilie de l'enfant porté par la femme III8 (bien qu'on ne sache pas faire la différence entre les allèles du gène considéré par les techniques déjà vues). Document 1 : arbre généalogique d'une famille ou s'exprime une maladie monogénique rare liée au sexe et récessive, l'hémophilie A; cette maladie est due a une anomalie d'un facteur de coagulation du sang, le facteur VIII, expression d'un gène situe sur le chromosome X. Document 2 : la jeune femme III8 est enceinte de six semaines; le médecin demande alors un caryotype du foetus (ci-dessous). Document 3a : on sait que le gène responsable du facteur VIII est de grande taille (186 Kb) et présente une grande diversité de mutations ponctuelles. On ne dispose pas de sonde intragénique permettant de distinguer l'allèle morbide de l'allèle codant le facteur VIII. On utilise une sonde extragénique ST14 ; cette dernière repère une zone très polymorphe, très proche du gène VIII. Le polymorphisme de cette zone extragénique comporte une dizaine d'allèles numérotés (dans cette famille, les allèles 2, 3 et 5 sont présents). Compte tenu de la distance très faible entre cette zone extragénique et le gène codant le facteur VIII, on estime à 4 % le taux de recombinaison. Document 3b : autoradiogrammes obtenus avec la sonde extragénique ST14 Le médecin demande une analyse de l'adn du chromosome concerné pour les parents III8 et III9, l'embryon et son cousin malade IV1. Des fragments d'adn de ce chromosome, après action des enzymes de restriction, sont sépares par électrophorèse puis hybridés avec la sonde ST14 ; on réalise une autoradiographie dont les résultats sont présentes ci-dessous.