Fanny Coulpier.

Transcription

1 Fanny Coulpier

2 Un peu d histoire 1953 : Découverte de la structure en double hélice de l ADN par James Dewey Watson, (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1962) : Découverte de l ADN polymérase ADN dépendante (ADN pol I) par Arthur Kornberg (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1959) : Co-découverte indépendante de l ADN polymérase ARN dépendante par Temin HM et Baltimore D (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1975) : Première publication publique sur la PCR par Kary Mullis (prix Nobel de chimie en 1993) : Première PCR réalisé avec une ADN polymérase thermostable, provenant de Thermus aquaticus, par Saiki RK : Première détection du produit de PCR par sonde (sonde d hydrolyse) par Holland PM : Invention de la PCR en temps réel par Higuchi R.

3 PCR:Polymerase Chain Reaction Elle permet d'obtenir, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant, d'importantes quantités d'un fragment d'adn spécifique et de longueur définie. L'ordre de grandeur à retenir est celui du million de copies en quelques heures. C'est, généralement suffisant pour une utilisation ultérieure.

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5 Techniques associées à la PCR PCR emboîtée ou PCR gigogne (Nested PCR) PCR en gradient de température PCR multiplexe PCR par essais (Touchdown PCR) PCR sur colonie (Colony PCR) RT-PCR (RT-PCR pour Reverse Transcriptase PCR) RT-PCR en une étape (single step RT-PCR) RT-PCR in situ (in situ RT-PCR) RT-PCR sur une cellule (single-cell RT-PCR) PCR quantitative (q-pcr pour quantitative PCR)

6 RT-PCR pour Reverse Transcriptase PCR L'acronyme RT-PCR signifie Reverse Transcriptase PCR, soit une PCR après transcription inverse d'un acide ribonucléique (ARN) en ADN complémentaire (ADNc). En réalité, il s'agit d'une PCR "classique" réalisée sur un ADN complémentaire (ou ADNc), qui est une copie d'un ARN obtenue par une transcription inverse. La RT-PCR a été mise au point pour utiliser les ARN comme matrice d'amplification de la PCR. Elle est certainement la méthode la plus sensible pour détecter (et éventuellement quantifier), les ARN messagers au niveau d'un organe, d'un tissu ou d'une cellule. Dans ce but elle est souvent réalisée in situ (cf. PCR in situ) c'est à dire sur du matériel biologique fixé. Elle est également utilisée pour la construction de banques d'adnc, le tri d'arnm (Differencial Display RT-PCR) ainsi que la construction de sondes d'adn. L'une des difficultés de cette méthode concerne la préparation des ARN qui peuvent être très facilement dégradés et contaminés par de l'adn génomique.

7 PCR en temps réel ou quantitative (PCR-Q) La PCR-Q Définition PCR-Q vs PCR classique Le matériel Chimies de détection Quantifications Principe du Ct Notion d efficacité Quantification Absolue / Relative Normalisation Bilan Avantages / inconvénients Domaine d application

8 Définition C est une technique destinée à pouvoir quantifier la quantité d un type d ARN initialement présent dans un échantillon. La réaction en chaîne par polymérase en temps réel est une technologie ayant de nombreuses applications, basée sur une réaction enzymologique, la PCR et sur la mesure en continue de son produit. A chaque cycle d amplification, la quantité d ADN total ou d amplicon est mesurée grâce à un marqueur fluorescent. L obtention de la cinétique complète de la réaction de polymérisation permet d obtenir une quantification absolue ou relative de la quantité initiale d ADN cible, ce qui était très difficile à obtenir sans biais en PCR en point final. Objectif principal de la plupart des biologistes, elle soulève de vives polémiques quant à l utilisation de calibrateur externe ou interne (gène de ménage). A l exception de complexes protocoles utilisant des calibrateurs externes homologues compétitifs, elle ne permet qu une quantification relative.

9 PCR en temps réel versus PCR en point final

10 Le matériel

11 Le matériel

12 Une PCR sur le light Cycler

13 Chimies de détection Intercalant de l ADN SYBER-green Quenching Sonde d hydrolyse (taqman)

14 Le SYBRGreen chimie non spécifique, liaison à l ADN double brin

15 La chimie «Syber-green Limite de la technique SYBER-green : risque de détection des dimères d oligonucléotides ou d un produit PCR non spécifique: contrôle lors de la mise au point par dépôt sur gel de la présence d une seule bande contrôle à chaque réaction de la présence d un seul produit PCR par évaluation du Tm du produit PCR à l aide de la courbe de fusion (contrôle qu il n y a bien qu un seul produit, avec le bon Tm)

16 La chimie Taqman Molécule fluo. Reporter Excitation 488nm Émission 520nm Molécule fluo. Quencher Excitation 510nm Émission 560nm

17 La chimie Taqman Nature des fluorochromes reporters : - FAM : bleu - VIC : vert - NED : noir - PET : rouge Avantages de la Q-PCR avec sondes : - très spécifique (car cette PCR nécessite l utilisation de deux amorces et d une ou plusieurs sondes spécifiques) - possibilité de faire des multiplexes : plusieurs PCR dans le même tube : détection de fluorochromes différents indicateurs de PCR différentes dans le même tube quantification relative directe, meilleure normalisation. Limites : coût des sondes (surtout si nombreux gènes à différents à quantifier)

18 La quantification par PCR en temps réel Bruit de fond

19 Le Ct(cycle threshold) ou Cp (crossing point)

20 Efficacité de la PCR L avènement de la PCR en temps réel a mis en exergue que l efficacité d une réaction de PCR (généralement notée (E) n était pas toujours égale à 100%. ) Si E=100%, à chaque cycle on a 2 n. Par contre si E # 100% on a alors (E+1) n Cela signifie que sur l ensemble des cycles considérés comme quantitatif tous les brins matrices ne servent pas forcément à donner une copie complète de l amplicon. Deux phénomènes en sont les principales causes : Tous les brins matrices ne sont pas forcément liés par un complexe amorce/polymérase lors de la phase d hybridation. Toutes les synthèses ne sont pas forcément complètes, notamment si la phase d élongation est trop courte. Cette efficacité est donc théoriquement inférieure ou égal à deux mais certaines sources considèrent qu elle est acceptable jusqu à 2,3!

21 Calcul de l efficacité de PCR E+1 = 1.915

22 Exemples

23 La quantification

24 Quantification relative vs absolue Dans le grande majorité des cas la PCR-Q consiste à comparer au moins 2 échantillons. Un échantillon sert de référence et la quantification des autres sera faites relativement à cette référence. Si le nombre de molécule de la référence est connue alors une quantité absolue pourra être assignée à chaque échantillon et l unité pour être un nombre de copies ou un nombre de molécules. Si le nombre de molécules n est pas connu on attribuera une valeur arbitraire à la référence (1,100%...) et il sera possible d assigner pour les autres échantillons des valeurs relatives à cette référence.

25 Quantification absolue par gamme standard externe

26 Quantification relative - pas besoin de courbe de standard - calcul des résultats par comparaisons des Ct - nécessité de définir : un gène servant de contrôle endogène, un échantillon de référence le contrôle endogène : - donne une image de la quantité de matrice apportée (ADN ou ADNc), - est présent en quantité constante dans tous les échantillons, - normalise : - les biais d extraction et de contaminations par des inhibiteurs (ADN) - les variations d éfficacité de transcription inverse

27 Quantification relative par la différence des Ct Inconnu N= No (1+E) Ct N=No 2 ct Témoin No inc. = N / 2 Ct No tém = N / 2 Ct R= No inc / No tém = 2 Ct / 2 Ct R= 2 -(Ct Ct) Ct inc ΔCt Ct tem R= 2 -ΔCt Quantité Relative

28 Quantification relative avec calcul de l efficacité de la PCR Gamme du témoin Gamme de l échantillon inconnu Calcul de la pente médiane qui peut être différent de 2 R= E -ΔCt

29 Courbe de fusion

30 Les sources de variabilité expérimentale

31 La normalisation Afin de corriger ses variations expérimentales, une normalisation est nécessaire: Pour l ADN génomique: une séquence spécifique du génome une séquence de l ADN mitochondrial Pour l ARNm une séquence d un transcrit «ubiquitaire»

32 Choix des séquences de normalisation Pour le génome: pas de copies multiples Absence de polymorphisme Pas de séquences similaires

33 Choix des séquences de normalisation Pour les ARNm Contrôle ARN endogène Le gène ubiquitaire= un mythe? L ARN ribosomale= Ct trop élevés Les classiques: β-actine, GAPDH, HPRT, UBC, s14, β2-microglobuline, TFIID. Normalisateur par rapport à un tissu spécifique: expl: l α-actine squelettique ou de la γ-actine pour les cellules sanguines

34 Quantification relative: Normalisation (1) R= No inc / No tém R= No inc / No tém Gène cible Gène réf Résultat brut Normalisation par un gène de référence R norm = R gène cible / R gène réf Résultat Normalisé

35 Quantification relative: Normalisation (2) R norm = R gène cible / R gène réf R= 2 -(Ct Ct ) X 2 cible -(Ct Ct) Réf R = 2 [ ΔCt cible - ΔCt ref] R norm = 2 - ΔΔCt

36 Quantification relative: Normalisation (3) Si Calcul de l efficacité: R norm = R gène cible / R gène réf R norm = E -(Ct Ct ) X E cible -(Ct Ct) Réf R norm =E -ΔCt cible X E - ΔCtRéf

37 Sensibilité des méthodes de quantification

38 Avantages de la PCR en temps réel sur la PCR classique Rapidité Contrôle qualité du produit (courbe de fusion) Identification facile de la phase informative, très courte (4-5 cycles) Mise en évidence des variations d éfficacité Résultats plus précis et plus fiable

39 Avantages Bilan de la PCR en temps réel Précision Spécificité Reproductibilité (réactifs optimisés) Sensibilité cellules unique, une copie Rapidité Coût accessible Pas de contamination Quantification absolue

40 Bilan de la PCR en temps réel Contraintes ou plutôt des exigences Mettre au point le système PCR Choisir une stratégie de Normalisation Maîtriser les sources de variabilité

41 Domaines d application de la PCR en temps réel Détecter / Quantifier Expression de gènes : transcrits Détermination de niveaux d expression ARNm Knock-Down de gènes (SiRNA) Validation des expériences de puces à ADN Gènes: Diagnostic prénatal(anomalies chromosomiques, maladies génétiques Diagnostics en oncologie (charge tumorale) Génomes Recherche de microorganismes (bactéries pathogènes, charge virale) Criblage des résistances antibiotiques

42 Champs d application Détecter/ Identifier Événement d insertion Transgenèse OGM Génotypage Oncologie Pharmacogénétique (SNP) Empreintes génétiques Études phylogénétiques

43 Mise en place d une manip de PCR-Quantitative dans le cadre de la validation de résultats obtenue par puce à ADN

44 Étude du transcriptome de cellules de Schwann: Comparaison de nerfs sciatiques de souris sauvages versus souris knock-out (krox-20 ),dépourvues de myélines WT -/- Ratio 0.5< 1 <2 Ratio <0.5 gène 1 = 0.35 Plus exprimé chez le Wt Ratio >2 gène 2 = 2.5 plus exprimé chez le mutant

45 Préparation des échantillons Utilisation si possible des mêmes ARN ayant servis pour les hybridations Sinon préparation d ARN dans les mêmes conditions RT pour obtenir l ADN complémentaire simple brin AAA AAA TTT TTT mutant (Inconnue) WT (Référence)

46 1-Les critères généraux: RECHERCHE DES AMORCES DE PCR Longueur des oligonucléotides = 16 à 26 nt Longueur de l amplicon = 100 à 200 pb (efficacité) Taux de GC = 40 à 70% ; teneur en GC et AT équilibrée en 3 et 5 Tm des oligonucléotides ~ 60 C(hybridation et élongation à 60 C)

47 RECHERCHE DES AMORCES DE PCR 2-Les critères de séquences: Répétitions de bases (G) <4 (efficacité de couplage) Éviter les structures secondaires : -intra amorce: épingle à cheveux -inter amorce: complémentarité des 3 Polymorphisme: oligos dégénérés (N) et doubler la concentration pour chaque site de dégénérescence.

48 RECHERCHE DES AMORCES DE PCR 3-Outils bioinformatiques Sélection des amorces et sondes avec un logiciel dédié En ligne Primer 3 PCR-Sélection d amorces Commerciaux Oligo 6.0 Primer Express Primer Designer Vérification de la spécificité par BLAST

49 Optimisation Choix d une paire d amorces: tester plusieurs paires (mesure d efficacité) Choix de la concentration des amorces Vérification de la spécificité: PCR sur ADNg et ADNc courbe de fusion et agarose

50 Effet «couple d amorces» sur l efficacité (1) C C1 Pour un même gène les Ct diffèrent en fonction des couples d amorces. Calcul de l efficacité de chaque couple et choisir le meilleur.

51 Effet «couple d amorces» sur l efficacité (2) L idéal est de calculer l E pour tous les couples d amorces. Choisir les couples qui ont des E du même ordre de grandeur.

52 Effet «concentration des amorces» sur l efficacité Choisir la concentration optimum, qui permet d avoir la meilleure efficacité

53 Récapitulatif On a choisi les meilleurs couples d oligos et la meilleur concentration pour: Gènes cibles: Gène 1 et gènes 2 Gènes de références: β-actine ou GAPDH On a nos ADNc préparés après RT sur les ARNt pour: ADNc Témoins: sauvage ADNc Inconnu:mutant

54 Efficacités de la PCR avec nos amorces Pente Efficacité 1+E Équation Gène % 2.05 N=No2.05 Ct Gène % 1.96 N=No1.96 Ct GAPDH % 1.93 N=No1.935 Ct Les efficacités sont correctes et similaires On peut analyser et normaliser les résultats

55 Rappel des équations R= No mut / No wt R= No mut / No wt Gène 1 GAPDH Résultat brut Normalisation par un gène de référence R norm = R gène 1 / R GAPDH Résultat Normalisé

56 Calcul du ratio pour le gène 1 WT (Témoin) Mutant (inc) E+1 R norm = R gène 1 / R GAPDH Gène 1 Gène R norm = E -(Ct Ct ) / E -(Ct Ct) GAPHD R norm = ( ) / 1.93 R norm = (-2.7) / (-0.33) -( ) R norm = 6.66 / 1.24 = 5.49 Gène 1 est 5.49x plus exprimé chez le mutant gène réprimé par krox-20

57 Calcul du ratio pour le gène 2 WT (Témoin) Mutant (inc) E+1 R norm = R gène 1 / R GAPDH Gène 1 Gène R norm = E -(Ct Ct ) / E -(Ct Ct) GAPHD R norm = ( ) / 1.93 R norm = (1.04) / (-0.33) -( ) R norm = 0.49 / 1.24 = 0.40 Gène 1 est 2.5x moins exprimé chez le mutant gène activé par krox-20

58 Ratios puce vs Ratios PCR-Q Gène 1 Gène 2 Ratio puce Ratio PCR-Q Refaire la PCR-Q sur 3 extractions d ARN indépendant et tests avec d autres contrôles. La validation par PCR-Q de résultats de puce à ADN doit être compléter par des hybridations In Situ

59 Analyse d échantillons alimentaires pour la présences d organismes génétiquement modifiés Détection du soja Roundup Ready(tolérantes à l herbicide glyphosate ) dans 3 échantillons par méthode PCR multiplexe

60 Les amorces et sondes Les sondes Taqman de lectine et de RR sont marquées respectivement avec les fluorochrome VIC et FAM qui ont une longueur d onde démission différentes. (Il faut un thermocylceur capable de détecter des fluorochromes multiples avec différentes longueurs d émission: hermocycleur ABI PRISM 7700) FAM VIC Sonde Taqman lectine Sonde Taqman (Réf) (cible) Les amorces F/R pour la lectine et RR sont choisies comme décrit précédement RR

61 Préparation de la courbe standard Il faut posséder des échantillons de soja où l on connaissent le % exacte de soja RR Et de l ADN de soja non transgénique en quantité constante 1-soja RR 0.1% + ADN 50ng 2-soja RR 0.5% + ADN 50ng 3-soja RR 1.2% + ADN 50ng 3-soja RR 5% + ADN 50ng Gamme Standard

62 Préparation du mastermix -Mix PCR: Mastermix (Taqman) Amorce Le-F Amorce Le-R Amorce-RR-F Amorce RR-R Sonde Le Sonde RR Pour une réaction + ADN échantillons (courbes standard ) + échantillons inconnus à tester (A B et C)

63 Établissement de la courbe standard 0.1% soja RR Ct le Ct RR ΔCt1 0.5% soja RR Ct le Ct RR ΔCt2 1.2% soja RR Ct le Ct RR ΔCt3 5 % soja RR Ct le Ct RR ΔCt4 Courbe : log(%) vs ΔCt ΔCt Log %

64 Calcul du ΔCt pour chaque échantillon Échantillon A ΔCt = CtRR CtLe Échantillon B ΔCt = CtRR CtLe Échantillon C ΔCt = CtRR CtLe

65 Estimation du % de soja RR présent dans les échantillons ΔCt Échantillon A = 0.35% de soja RR ΔCtA Echantillon B = 1.07% de soja RR ΔCtB ΔCtC Echantillon C = 3% de soja RR Log %

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