Immunotypage: technique de confirmation et identification des immunoglobulines monoclonales en milieu capillaire

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1 Immunotypage: technique de confirmation et identification des immunoglobulines monoclonales en milieu capillaire 22 Octobre 2013 Lionel BEY Département Diagnostic SEBIA

2 Où trouver les immunoglobulines polyclonales? Immunoglobulines: Ig G polyclonales (gamma) Ig A polyclonales (beta 2- gamma) Ig M polyclonales(gamma) -1 glycoprotéine acide -1 antitrypsine Complément C3 Haptoglobine Transferrine -2 macroglobuline Hemopexine

3 Anomalies sur l électrophorèse des protéines pour lesquelles un immunotypage est recommandé Présence d un pic ou d une déformation en gamma Présence d un pic additionnel ou d une déformation additionnelle en bêta 1 ou bêta 2 Bêta 2 bêta 1 hors contexte inflammatoire ou atteinte hépatique (fractions alpha 1 et alpha 2 augmentées, albumine diminuée) Augmentation isolée ou non de la bêta 1 (sans contexte d hémolyse ou d anémie ferriprive) Valeur alpha 2 du patient > valeur alpha 2 de référence hors contexte inflammatoire

4 Anomalies nécessitant un Immunotypage Tout pic ou toute déformation visible dans la zone gamma

5 Anomalies nécessitant un Immunotypage Augmentation de la zone bêta-1 (hors légère augmentation des bêta-1 dans les anémies ferriprives) Toute déformation de la zone bêta-1 surtout si associée à une hypogammaglobulinémie

6 Anomalies nécessitant un Immunotypage Augmentation de la zone bêta-2 (bêta-2 bêta-1) hors contexte inflammatoire ou hépatique Déformation de la zone bêta-2 surtout si associée à une hypogammaglobulinémie Pic monoclonal en bêta-2 Pic monoclonal ou fibrinogène? Confirmation par immunotypage

7 Anomalies nécessitant un Immunotypage Augmentation de la zone alpha-2 (sérum non hémolysé, hors contexte inflammatoire ou néphrotique ), surtout si cette augmentation est associée à une hypogammaglobulinémie Dédoublement de la zone alpha-2 est, le plus souvent, le signe d un phénotype hétérozygote de l haptoglobine ou d hémolyse et pas d une protéine monoclonale: Phénotype II - II Phénotype I - I Phénotype I - II

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9 Demande d Immunotypage en Protéine 6 Sélectionner la dilution (Selon la concentration totale en Ig en g/l) - Hypogamma (Ig<8g/l ) - Standard (Ig 8-20g/l) - Hypergamma (Ig>20g/l) Demande IT

10 Pic monoclonal en Gamma. Concentration totale des Igs est estimée à 13,7 g/l Dilution STANDARD

11 Pic monoclonal en Gamma. Concentration totale des Igs est estimée à 4,2 g/l Dilution HYPOGAMMA

12 Pic monoclonal en Beta-1. Concentration totale des Igs est estimée à 30,4 g/l (fractions Gamma + Beta-1) Dilution HYPERGAMMA Ne Pas utiliser HYPOGAMMA!

13 Pourquoi choisir la bonne dilution d immunotypage? Utilisation d une mauvaise dilution peut induire: Une soustraction incomplète s il n y a pas assez d antisérum en comparaison aux immunoglobulines (monoclonale ou polyclonales) présents dans l échantillon Manque de visibilité sur le cas car le sérum est trop dilué

14 Erreur du choix de dilution: standard au lieu de hypergamma Effet de zone pour une forte Ig monoclonale sur gel non assez diluée. Confusion possible avec 2 bandes en cas d observation non attentive Résiduel par manque de dilution du sérum

15 Quand choisir la dilution «Optimisée»? Dans de rare cas, où l immunotypage présenterait des réactions multiples simultanées avec les antisérums anti-igg, IgA ou IgM, le sérum doit être ré-analysé en dilution «Optimisée» pour Capillarys/Minicap (Une version Phoresis 8.60 est obligatoire). Cette procédure modifie le rapport entre l'antigène et l'anticorps. Dans certains cas, quand les protéines monoclonales adoptent une conformation particulière, qui provoque des réactions simultanées avec plusieurs chaînes lourdes (formation de complexes immuns..). Remarque: si les réactions multiples impliquent l anti-kappa et l anti-lambda et/ou les anti-chaînes lourdes, un traitement réducteur au bêtamercaptoéthanol 1% doit être réalisé et non une dilution optimisée.

16 Dilution «Optimisée» IgG Lambda or IgA Lambda? Réactions multiples simultanées Réanalyser en dilution «Optimisée»

17 Quand choisir la dilution «Optimisée»? Remarque: Capillarys avec Phoresis < 8.60, Déposer 45 µl d échantillon à analyser dans le double-puits de la barrette antisérums contenant le diluant échantillon et homogénéiser par pipetages successifs. Disposer la barrette de sérum dilué sur un rack ainsi que le tube contenant l échantillon en position 1. Réaliser l analyse, dans les plus brefs délais, en sélectionnant la dilution STANDARD

18 Principe de l immunotypage Formation des complexes avec les antisérums en milieu liquide Les complexes migrent dans la position anodique, hors la zone de gammas

19 Immunotypage: Interprétation Le complexe immun formé migre en position anodique: plus anodique que l'albumine ou entre l albumine et la fraction alpha 1. Le pic monoclonal est identifié quand le pic disparaît avec un anticorps anti-chaîne lourde (G, A or M) et/ou un anticorps anti- chaîne légère kappa ou lambda.

20 Comment définir un échantillon normal sur un immunotypage?

21 Echantillon normal

22 ELP G A ~ 80% IgG ~ 15% IgA M K L ~ 5% IgM 2/3 Kappa 1/3 Lambda

23 Comment définir une augmentation polyclonale sur un immunotypage?

24 Pic monoclonal ou Augmentation polyclonale en gamma? Sommet pointu Sommet arrondi Base étroite Pic monoclonal IT Soustraction complète du pic avec un antisérum anti-chaîne lourde et anti-chaîne légère Base large Augmentation polyclonale IT Soustraction complète du pic avec un antisérum anti-chaîne lourde et partielle en kappa et lambda

25 Sommet pointu Fort pic monoclonal à l électrophrorèse des protéines Base étroite Sommet arrondi Base large Forte augmentation polyclonale des Ig G à l électrophrorèse des protéines

26 Augmentation polyclonale des Ig G 2/3 IgG Kappa polyclonales 1/3 IgG Lambda polyclonales

27 Augmentation polyclonale en bêta?

28 Caractéristiques d une augmentation polyclonale des Ig A: Bloc entre la bêta 2 et les gammas L augmentation de la bêta 2 couvre une grande largeur de la courbe Le pic de bêta 2 diminue de façon sensiblement identique sur les 2 chaînes légères

29 En bêta 2, il faut toujours considérer la présence du complément C3? C3 C3 IgM kappa C3 C3 C3 Le complément C3 peut varier en intensité mais comme il ne s agit pas d une immunoglobuline, il sera toujours visible après soustraction de l anomalie monoclonale

30 Pas de soustraction de l anomalie en bêta 2, quoi envisager? L anomalie n est donc pas d origine immunoglobulinique mais il s agit d une protéine ou d une molécule interférente absorbant à 200nm (par ex: fibrinogène ou produits de contraste pour radiographie)

31 Principe d interprétation et exemples

32 Interprétation pas à pas Commencer par analyser attentivement les courbes sans zoom (afin de voir l ensemble du tracé) Localiser l anomalie sur la piste ELP (pic en gamma? déformation des bêta-2?...) Utiliser la fonction «zoom» pour agrandir la zone d intérêt (zone des bêta-2- gamma + éventuellement zone bêta-1 voire alpha-2, si une anomalie est suspectée dans ces zones) Si nécessaire, utiliser l affichage en lissage 0 pour accentuer l aspect des déformations

33 Interprétation pas à pas Une fois l anomalie localisée, regarder son comportement sur les pistes des chaînes lourdes (G, A, M) et des chaînes légères (kappa, lambda). Identifier les pistes où l anomalie disparaît Regarder le parallélisme de la courbe bleue (avec antisérum) avec la courbe jaune (sans antisérum)

34 Ig G Ig A Ig M Kappa Lambda

35 Cas n 1: Electrophorèse en programme Protéine 6 Alb 1 1 2

36 Cas n 1: Immunotypage Zoom

37 Cas n 1: IgG lambda

40 Cas n 2: IgM kappa

41 Cas n 3: Electrophorèse en programme Protéine 6 Beta 2 Beta 1 hors contexte inflammatoire ou atteinte hépatique : Faire un immunotypage Alb 1 1 2

42 Cas n 3 : Immunotypage Zoom

43 Cas n 3: IgA kappa Beta 2 = complément C3

46 Cas 4: IgA Lambda entre bêta-1 et bêta-2 Bêta 1 Bêta 2

47 Cas 5: Electrophorèse en programme Protéine 6 Immunotypage requis car le taux de protéines est normal. Il ne s agit pas d un syndrome néphrotique Alb 1 1 2

48 Cas n 5: : IgA kappa en alpha 2

49 Interprétation pas à pas La même protéine monoclonale migre au même endroit sur toutes les pistes (règle à ne pas oublier dans l interprétation des gammapathies biclonales )

52 Cas n 6 : IgG lambda et faible IgA Kappa

55 Cas n 7 : IgA kappa et IgG lambda

56 Interprétation pas à pas Regarder attentivement les courbes résiduelles (courbes bleues après la soustraction): - Avons-nous récupéré le tracé normal? Ou la courbe résiduelle reste toujours déformée? - Un pic peut en cacher un autre! La soustraction d une classe des immunoglobulines sur une piste peut accentuer une anomalie qui «se cachait» dessous

57 Cas n 8: co-migration entre 2 immunoglobulines monoclonales Alb 1 1 2

58 Sérum normal 1 seul pic monoclonal mais IgM kappa et IgM lambda co-migrantes en gamma IgM L IgM K

59 Cas n 9: Immunotypage

60 Cas n 9: IgG lambda et une igm kappa Après la soustraction de l IgG lambda, un autre pic devient visible

61 Cas n 10: Immunotypage IgG IgM IgM IgG L interprétation est possible, mais on peut la faciliter!

62 Traitement au Bêta Mercaptoéthanol pour séparer des Ig co-migrantes: * Préparer une solution réductrice à 1% de BME: - 90µL H2O + 10µL BME - 10µL BME au 1/ µL Fluidil (ref 4587) * 100µL de la solution réductrice + 300µL sérum * Laisser en contact 10 mn à température ambiante * Introduire le tube dans Capillarys ou Minicap en s assurant qu il n y ait pas d autre tube en attente dans l automate A faire uniquement dans ces cas de co-migration IgG/IgA ou IgG/IgM; S il s agit de deux IgM ou deux IgA, le traitement peut compliquer l interprétation en superposant les deux protéines sur les bêta-2!

63 Cas n 10: IgG kappa + IgM Lambda IgG K IgM L Après traitement au BME

65 Cas n 11: IgA lambda, IgG kappa et IgG lambda

66 Cas n 12: IgM kappa polymérisée et IgM lambda co-migrante en bêta 2- gamma IgM L IgM K

67 Cas n 13: forte IgG kappa + très faible IgG lambda en gamma

68 1 ou 2 Ig monoclonales?

69 Lissage 0 2 IgG kappa Lissage 2

70 Cas n 14: bêta 2 bêta 1 sans contexte inflammatoire Alb 1 1 2

72 Cas n 14: IgM kappa sur fond d Ig A polyclonales en bêta 2 Ig A polyclonales IgM K

74 Cas n 15 : IgA lambda sous 2 formes de polymérisation (ou deux IgA lambda distinctes; à confirmer par un traitement au BME)

76 Cas n 16: IgM kappa très polymérisée

79 Cas n 17: IgG lambda et chaînes légères lambda libres polymérisées (ou Ig/DE) A confirmer par immunofixation sur gel avec les antisérums anti-lambda libre (anti-ig D/E)

80 Profil oligoclonal Présence de multiples déformations dans la zone des gamma associées à: - Des traitements immunosuppresseurs lors de maladies auto-immunes (arthrite rhumatoïde, lupus érythémateux, syndrome Gougerot Sjögren) ou à la suite de transplantations - Les infections à CMV, H.I.V, les hépatites virales (hépatite C.) - Certains processus néoplasiques (cancers digestifs, leucémie myélomonocytaire) L origine de ces Ig reste indéterminée mais beaucoup d arguments plaident en faveur d une dysrégulation du système immunitaire

83 Cas n 18: Profil oligoclonal en Ig G en gamma (avec Ig G lambda prédominante à recontrôler)

85 Cas n 19: Profil oligoclonal en Ig G en gamma

86 Cas n 20: Immunotypage

87 Cas n 20: IgA Lambda en bêta chaînes légères libres lambda en bêta 2 Lambda libre

88 Cas n 21: Une forme d augmentation polyclonale sur les gammas mais présence d un pic ou d une déforme, faire un immunotypage Alb 1 1 2

89 Pic monoclonal ou Augmentation polyclonale en gamma? Sommet pointu Sommet arrondi Base étroite Pic monoclonal IT Soustraction complète du pic avec un antisérum anti-chaîne lourde et anti-chaîne légère Base large Augmentation polyclonale IT Soustraction complète du pic avec un antisérum anti-chaîne lourde et partielle en kappa et lambda

90 Augmentation polyclonale des Ig G + IgG lambda sousjacente en gamma A recontrôler dans 3 à 6 mois hors réponse immune

91 Cas n 22: Augmentation polyclonale des IgA et des IgG avec bandes sous-jacentes A recontrôler dans 3 à 6mois hors réponse immune

92 Recommandations avancées de l interprétation des immunotypages Dans les cas difficiles, utiliser les informations données par les courbes résiduelles sur les chaînes légères puis les chaînes lourdes: position, forme et intensité du pic restant. Observer attentivement la différence de soustraction de l anomalie par l antisérum anti-chaîne lourde et anti- chaîne légère afin de déceler la présence d une chaîne légère libre En cas de soustraction partielle, vérifier que la dilution choisie pour la réalisation de l IT est correcte En cas de soustraction généralisée, vérifier que la superposition des courbes est correcte (observation en mode non zoomé) En cas de demande sans électrophorèse préalable, vérifier les soustractions sur l ensemble des fractions alpha 2, bêta 1, bêta 2 et gamma Utiliser l option de lissage 0 sur l électrophorèse afin de vérifier la présence potentielle de 2 anomalies sur un pic

93 Merci de votre attention!