Vaccinations cellulaires anti tumorales

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1 Vaccinations cellulaires anti tumorales M2 Biothérapies 1 er Décembre 2011 Claude LEMARIÉ Pharmacien Biologiste CTCG [email protected]

2 Rationnel de l Immunothérapie anti tumorale Immunogénicité des tumeurs: Incidence accrue des tumeurs chez les souris immuno déficientes (Dighe A. Immunity 1994), vérifié chez l homme (Euvrard S, NEJM 2003). Expression de nombreux Ag associés aux tumeurs (TAA) par les cellules tumorales: Ag de différenciation (MELAN-A/MART1), Ag germinaux (MAGE-A1), Ag du soi surexprimé (Her2/neu), Ag mutés (van der Bruggen P, Science 1991; Gilboa E, Immunity 1999). Effecteurs : Démonstration in vitro du rôle des LT dans la réponse anti tumorale (Greenberg P, Adv. Immunol. 1991), rôle des LT CD8+ (Albert M, Nat Med 1998). Confirmation chez l animal du rôle des LT et de l INF-γ (Shankaran V, Nature 2001). Réponse immune spontanée contre les TAA chez certaines patientes (Ac, LT cytotoxiques, LT mémoires) (Wang W, Cancer Res 2006)

3 Effecteurs Banchereau J, Nature Rev. Immunol. 2005

4 L immunothérapie anti-tumorale Passive Active Ac Cellules tumorales mortes Peptides, protéines, ADN, ARN LT NK NK LT DC Schéma T.Simon

5 Lymphocytes T αβ C Resolved Infection From Freeman G JEM 2006

6 Immunothérapie cellulaire active: vaccination par Cellules Dendritiques Objectif: stimuler la réponse immune antitumorale adaptative (et innée). Type d Immunothérapie: active, cellulaire, autologue, spécifique d Ag, thérapeutique curative et préventive de la rechute. Rationnel d une immunothérapie par Cellules Dendritiques: 1) seules cellules présentatrices d Ag (CPA) capables de stimuler les LT naïfs, 2) seules CPA pouvant stimuler les LT CD4+ et CD8+ avec des Ag exogènes, 3) anomalies fonctionnelles des DC mises en évidence chez les patients atteints de cancers.

7 Cross Présentation Tacken P Nat rev Immunol 2007

8 Origine des Cellules Dendritiques

9 Biologie des DC myéloïdes immatures CD immature CD mature DC immatures: capture antigénique from Moser M, Nature Immunology 2000

10 Signal de danger: 1 er signal donné en périphérie Simon T Immunotherapy 2009

11 Biologie des DC myéloïdes matures CD immature stimuli inflammatoires CD mature DC matures: CPA from Moser M, Nature Immunology 2000

12 Interraction avec LT CD4+: 2 nd signal donné dans les ganglions Simon T Immunotherapy 2009

13 Les essais cliniques de vaccination par DC

14 Vaccination par Cellules Dendritiques: en pratique From Tacken P Nat rev Immunol 2007

15 Vaccination par Cellules Dendritiques: historique ere observation des DC dans la peau Production in vitro de DC à partir de Monocytes Congélation de doses de DC de grade cliniques FDA autorise la mise sur le marché du Provenge (Dendreon) DC = CPA capables de stimuler LT naïfs Cytotoxiques et Helper 1er essai de vaccination anticancéreuse par DC (LNH) 1000 patients vaccinés par DC (98 essais cliniques) Identification des Ag Associés aux Tumeurs (TAA) 1er essai de vaccination par DC dans les tumeurs solides (Mélanome) 1er essai de phase III (K Prostate, Dendreon)

16 Vaccination par DC: pathologies étudiées Ridgway D, Cancer Invest 2003

17 Vaccination par Cellules Dendritiques: résultats publiés dans le cancer du sein Triozzi PL, Cancer 2000 Brossart P, Blood 2000 Dees EC, Cancer Immunol Immunother 2004 Vonderheide RH, Clin Canc Res 2004 Svane IM, Cancer Immunol Immunother 2004 Brossart P, Blood 2000 Pecher G, Cancer Immunol Immunother 2004 Loveland BE, Clin Canc Res 2006 Kobayashi T, Surg Today 2001 Avigan D, Clin Canc Res 2004 from Pinzon-Charry A, Expert Opin. Biol. Ther. 2006

18 Vaccination par DC: TAA ciblés

19 Vaccination par DC: Ag vaccinaux

20 Vaccination par DC: degré de maturation des DC

21 Maturité des DC utilisées Simon T Immunotherapy 2009

22 Agents de maturation utilisés Simon T Immunotherapy 2009

23 Vaccination par DC: voie d injection (1/2)

24 Calendrier des injections: Figdor C. Nature Med 2004

25 Vaccination par DC dans le cancer du sein : réponse clinique

26 Vaccination par DC: réponse clinique Banchereau J, Nature Med., % des patients traités Ridgway D, Cancer Invest 2003

27 Essais Dendreon (Provenge ): Cancer de la Prostate

28 Essais récents avec mdc - Bahl S Am J Surg 2009 : 6 peptides de her 2 neu (CMH II ) All patients demonstrated evidence of CD4+ T cell response to at least one peptide. -Park JCO 2007: Dendreon prot de fusion Her-2 / Gm-CSF Significant cellular immune responses specific for the immunizing antigen and HER-2 sequences were induced after treatment, as measured by lymphocyte proliferation and INF-γ ELISPOT assay. One patient experienced a PR lasting 6 months. Three additional patients had SD lasting more than 1 year. - Czerniecki Canc Res 2007: Peptides de classe I et II diminution significative de l expression Her2 à la surface tumeurs (7 pt/11). Immunisation CD4 et CD8, et infiltrat tumoral par CD4+ (Fox p3-) diminution significative de la masse tumorale chez patientes vaccinées / non vaccinées chez 5 Pt /11 ; les mêmes dont l expression Her 2 neu a diminué.

29 Vaccination par DC: réponse immune

30 Vaccination par DC: Effets secondaires Très fréquents mais peu graves, fréquence peu différente des groupes placebo. <10 % SAE de grade III (résolutifs en moins de 24h): frissons, fatigue, douleurs lombaires douleurs musculaires, hypertension, hypokaliémie. Ridgway D, Cancer Invest 2003 Kantoff P NEJM 2010

31 Les raisons des échecs passés

32 DC efficaces mais Patients à un stade avancé de la maladie (forte masse tumorale) : régression observées chez patients avec faible masse tumorale (Maier et al. 2003) Résistance tumorale : défaut de présentation des antigènes (Campoli et al. 2002) Résistance à l apoptose, protéase anti-granzyme B et perforine, perte d expression de Fas (Evan et al. 2001, Malmberg et al.2006 Landowski et al. 1997) Environnement tumoral immunosuppresseur (Li et al. 2006) LT régulateurs (Ormandy et al. 2005)

33 Conclusions des essais cliniques (1/3) Réponses biologiques : induction d une réponse T spécifique chez la plupart des patients Maturité des DC: La moitié des essais effectués avec des idc = tolérogènes Cocktail et durée de maturation adequat toujours à l étude. Mode d injection : IV: DC restent dans les poumons LT8 cytotoxiques et mémoires stimulés en moins grand nombre. SC, ID, Intra ganglion? Nbre d injections : Induction d une réponse immune après ~ 3 injections. Maintien de la réponse spécifique si injections multiples. Nbre et fréquence?

34 Conclusions des essais cliniques (2/3) Quels Antigènes: 1) Approche Multi Ag (lysats, exosomes, fusion, mrna transfectés): intéressant si TAA non identifiés, mais manipulation complexes et immunomonitoring plus restreint. Pas de supériorité évidente en terme de réponse clinique. 2) Approche mono Ag (peptides): cibles et HLA restreints, mais immunomonitoring complet. Cibler plusieurs Ag: corrélation réponse T et survie si immunisation contre > 2Ag. Stimuler LT CD8+ et CD4+ : stimulation LT CD8+ mémoire à long terme Analyser la réponse clinique à long terme: corrélation réponse T et survie, pas de corrélation entre réponse T et réduction masse tumorale immédiate (CR, PR).

35 Corrélation survie globale / réponse immune spécifique p= Palucka J Immun Rev 2007

36 Cibler l utilisation des DC à certains groupes de patients Groupe Mes: surexpression gènes de l inflammation Prins R Clin Can Res 2011

37 Conclusions des essais cliniques (3/3) Traiter des pathologies moins avancées: stade >III: Treg augmentés LTCD8+ cytotoxiques et mémoires immunosupprimés, pas d efficacité de la thérapie cellulaire hématopoïétique allogénique sur pathologies avancées ou en progression: Combiner immunothérapie et chimiothérapie(s): Coinjection de cytokines: Autres

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39 Conclusions des essais cliniques (3/3) Traiter des pathologies moins avancées: Combiner immunothérapie et chimiothérapie(s): inhiber suppression par Treg, accroître l immunogénicité tumorale: Survie > chez des patients atteints de glioblastome traités avec DC puis chimio vs DC ou chimio seule (Wheeler CJ, Clin Cancer Res 2004).. Coinjection de cytokines: GM-CSF + pep / pep seul : réponse T plus intense et plus longue (> 24 mois après dernière vaccination). les cytokines proinflammatoires pourraient augmenter la migration des DC vers les ganglions. Autres DC + Trastuzumab

40 Prochainement à l IPC Essai Theracell 01 (1/2) Promoteur: IPC Principe: Etude de phase I d immunothérapie des cancers du sein métastatiques par induction d une réponse aux antigènes associés aux tumeurs. Objectif principal: Démontrer l induction d une réponse dirigée contre les antigènes associés aux tumeurs chez des patientes traitées par DC autologues matures chargées avec peptides de 4 TAA (Her/2-neu, MAGE-A1, NYESO/LAGE-2 et MAGE-A3). Spécificités de cette étude: 1) Ciblage spécifique des LT CD4+ (peptide de MAGE-A3 restreint HLA DP4) et des LT CD8+ (peptides de Her/2-neu, MAGE-A1, NYESO/LAGE-2 restreints HLA A2), 2) Vaccination par DC matures.

41 Prochainement à l IPC Essai Theracell 01 (1/2) Critères d inclusion: - Expression des TAA vaccinaux par la tumeur primitive ou les métastases: HER-2/neu +++, MAGE-A1, MAGE-3 et NYESO-1/LAGE-2 + (immunohistochimie, RT- PCR), - Traitement antérieur par anthracyclines, taxanes et trastuzumab, - Délai dernière chimiothérapie (ou immunosuppresseur) - Cytaphérèse > 30 jours, - Pas d immunodépression profonde: numération normale des cellules CD4+ et CD8+, - HLA-A201 et HLA-DP4. Critères de non inclusion: - Non réponse aux traitements de la maladie métastatique, - Espérance de vie < 3 mois, - Métastases cérébrales ou du système nerveux central. Critères de sortie d essai: - Pas d obtention de DC matures, - Toxicité importante, - Progression, - Souhait de la patiente.

42 La mise au point d un essai clinique de vaccination par DC (ou autre Immunothérapie Cellulaire)

43 Etapes préalables à l ouverture d un essai clinique d Immunothérapie cellulaire Préclinique, Transfert, Optimisation. Demandes d autorisations (COS, CPP, AFSSaPS) Reproductibilité, constitution des dossiers réglementaires

44 Transfert vers un procédé de grade clinique Prélèvement cellulaire Sélection des précurseurs Différenciation (Chargement des idc avec les Ag vaccinaux) Maturation Congélation des mdc Décongélation / Lavage (Mise en seringue) Transfert vers une production de DC de grade clinique: Sélection de réactifs, consommables et équipements autorisés pour leur usage en thérapeutique humaine. Locaux adaptés aux préparations de PTC en milieu ouvert ou semi ouvert pour limiter le risque de contamination microbiologique des PTC (travail sous PSM classe A dans une pièce de classe D : décision du 27/10/2010): air filtré, surpressions, portes asservies, habillage spécifique, contrôles environnementaux. Production à grand échelle: Évaluation de la reproductibilité du procédé: (Injection)

45 Transfert vers un procédé de grade clinique Prélèvement cellulaire Sélection des précurseurs Différenciation (Chargement des idc avec les Ag vaccinaux) Maturation Congélation des mdc Décongélation / Lavage (Mise en seringue) Transfert vers une production de DC de grade clinique: Réactifs, consommables et équipement autorisés pour leur usage en thérapeutique humaine, Niveau 3 de transformation cellulaire (arrêté du 16/12/1998). Production à grand échelle: Optimisation du procédé de production, Contrôle des cellules produites. Évaluation de la reproductibilité du procédé: Différenciation de cellules de donneurs et de patientes, Évaluation quantitative et qualitative des DC générées, Définition de critères de libération des vaccins. (Injection)

46 Transfert vers un procédé de grade clinique: J0: prélèvement des précurseurs Prélèvement cellulaire Sélection des précurseurs Prélèvement par Cytaphérèse des précurseurs: (Cobe Spectra) Prélèvement de Cellules Mono Nucléées incluant les précurseurs de DC (CD14+) Différenciation (Chargement des idc avec les Ag vaccinaux) Maturation Congélation des mdc Décongélation / Lavage (Mise en seringue) (Injection)

47 Transfert vers un procédé de grade clinique: J0: sélection des précurseurs monocytaires (2/2) Prélèvement cellulaire Sélection des précurseurs Différenciation (Chargement des idc avec les Ag vaccinaux) Immunosélection magnétique: Sélection positive CD14+ (Clinimacs ) automatique (standardisé), pas de Ficoll préalable, pureté élevée, utilisable en préclinique + clinique, automate «multi applications», coût élevé. Maturation Congélation des mdc Décongélation / Lavage (Mise en seringue) (Injection)

48 CliniMacs

49 Sélection positive des CD14+ Enrichissement CD14+ Marquage cellules CD14+ (à purifier) avec Ac anti CD14 couplés à des billes métalliques Elution des cellules CD14- Enrichissement des cellules CD14+

50 Transfert vers un procédé de grade clinique: J0 à J7: différentiation in vitro Prélèvement cellulaire Différenciation en poches avec milieu de culture et cytokines de grade clinique Sélection des précurseurs Différenciation (Chargement des idc avec les Ag vaccinaux) Maturation Congélation des mdc Décongélation / Lavage (Mise en seringue) J0 J6 (Injection)

51 Transfert vers un procédé de grade clinique: J0 à J7: différentiation in vitro Prélèvement cellulaire Sélection des précurseurs Différenciation Maturation avec cytokines de grade clinique Chargement des idc avec les Ag vaccinaux Maturation Congélation des mdc Décongélation / Lavage (Mise en seringue) J0 J6 J7 (Injection)

52 Transfert vers un procédé de grade clinique: J0-J7: Contrôles de qualité qualitatifs et quantitatifs Prélèvement cellulaire Sélection des précurseurs J0 J6 J7 Monocyte DC immature DC mature Différenciation (Chargement des idc avec les Ag vaccinaux) Maturation Congélation des mdc Décongélation / Lavage (Mise en seringue) (Injection)

53 Transfert vers un procédé de grade clinique: J7: congélation Prélèvement cellulaire Mise en poches, descente en température programmée, conservation en azote vapeur. Sélection des précurseurs Différenciation (Chargement des idc avec les Ag vaccinaux) Maturation Congélation des mdc Décongélation / Lavage (Mise en seringue) (Injection)

54 Transfert vers un procédé de grade clinique: J>8: décongélation / lavage Prélèvement cellulaire Sélection des précurseurs Décongélation: Bain-Marie 38 C. Différenciation (Chargement des idc avec les Ag vaccinaux) Maturation Congélation des mdc Décongélation / Lavage (Mise en seringue) Lavage: centrifugation. (Injection)

55 Transfert vers un procédé de grade clinique: décongélation (J>8): test fonctionnel Prélèvement cellulaire MLR allogénique (Mixte Lymphocyte Reaction): Sélection des précurseurs Différenciation (Chargement des idc avec les Ag vaccinaux) DC matures décongelées Lymphocytes allogéniques marqués (CFSE) + Maturation Congélation des mdc Nombre de divisions: Nombre de divisions: Décongélation / Lavage (Mise en seringue) (Injection) Counts % CFSE

56 Transfert vers un procédé de grade clinique Prélèvement cellulaire Sélection des précurseurs Différenciation (Chargement des idc avec les Ag vaccinaux) Maturation Congélation des mdc Décongélation / Lavage (Mise en seringue) Transfert vers une production de DC de grade clinique: Réactifs, consommables et équipement autorisés pour leur usage en thérapeutique humaine, Niveau 3 de transformation cellulaire (arrêté du 16/12/1998). Production à grand échelle: Optimisation du procédé de production, Évaluation de la reproductibilité du procédé: Différenciation de cellules de plusieurs donneurs et patientes, Évaluation quantitative et qualitative des DC générées, Définition de critères de libération des vaccins. (Injection)

57 Essais de reproductibilité : caractérisation du produit cellulaire initial, intermédiaire Produit cellulaire mis en culture : Viabilité et Rendement cellulaire du tri CD 14+ Produit cellulaire à chaque étape de la culture : Viabilité et Rendement cellulaire des étapes de culture: Ex d un test quantitatif (mesure de l expression des marqueurs de différenciation et maturation): J6 J7

58 Résultats des essais de reproductibilité : caractérisation du produit cellulaire final Caractérisation du produit cellulaire décongelé: Viabilité des mdc décongelées, Rendement de décongélation, Stabilité des mdc décongelées (définition h. de péremption). Ex d un test qualitatif (Prolifération mesurée par MLR allogénique): Test: DC + LT Contrôle négatif: LT seuls 26% 0.5 %

59 Définition des Valeurs Attendues Prélèvement cellulaire par aphérèse non CD14 > oui Chargement des idc avec des peptides CNT < oui non Division du PTC et réalisation de 2 cytomates Maturation J0 Lavage/marquage sur Cytomate CNT < CD14 < non Division du PTC et réalisation de 2 tris CD14+ non Rendement CN>10% Maturation des DC viables >70% (marqueurs à déterminer) Pureté des DC J7> 80% (FSC/SSC) J7 non oui Tri des monocytes CD14+ CD14 > oui Critères de libération oui Congélation des mdc Décongélation/lavage (mise en seringue) J6 non Différenciation Rendement CN viv >20% Culture microbio J0 négative % CD14+ < 15% MFI CD40 > 50% non Cultures microbio J7 négatives MLR de mdc décongelées entre J7 et l injection 1 positive (seuil à déterminer) Quantité de mdc vivantes à injecter >1x10 e7 oui Inj oui Injection

60 Critères de libération des vaccins: Contrôle de Qualité effectué avant congélation: Cultures micro biologiques aérobies et anaérobies: négatives Pureté des DC > 80% (FSC/SSC) Différenciation suffisante à J7: perte CD14: <20% Maturation suffisante à J7: % cellules Topro3- / CD83+ > 70% CQ effectué sur chaque dose après décongélation et lavage: Coloration de Gram: négative Dose de cellules viables: dose à injecter (1x10e7).

61 Immuno monitoring de l essai clinique

62 Immuno Monitoring: Analyse réponse immune induite par le vaccin Comparaison de l immunité spécifique: avant, pendant et à après vaccinations. Evaluation de la réponse immune induite: 1) Test in vivo: test d hypersensibilité retardée (DTH): injection ID des Ag vaccinaux, évaluation du diamètre d induration. 2) Test in vitro: prélèvement des CMN circulantes: - Quantitatif: Evolution du % de LT spécifiques des Ag vaccinaux: mesure par cytométrie (Tétramère) des CD3+/8+ et CD3+/4+. Ne s applique qu à la vaccination par DC+ peptides. - Qualitatif

63 Évaluation quantitative des effecteurs: Tétramère Side Scatter Tetramer Forward scatter CD8

64 Immuno Monitoring: Comparaison de l immunité spécifique: avant, pendant et à après vaccinations. Evaluation de la réponse immune induite: 1) Test in vivo: test d hypersensibilité retardée (DTH): injection ID des Ag vaccinaux, évaluation du diamètre d induration. 2) Test in vitro: prélèvement des CMN circulantes: - Quantitatif - Qualitatif : mesure de la fonctionnalité de ces LT spécifiques: Sécrétion de cytokines (ELISPOT, ELISA, FACS), Prolifération, Cytotoxicité

65 Évaluation qualitative des effecteurs: ELISPOT Contrôle négatif: Peptide test:

66 Évaluation qualitative des effecteurs: MLR Nbre de divisions: Nbre de divisions: DC allo + Lymphocytes marqués Counts CFSE % CD CD CD CFSE CFSE CD4 # Cells % 84.2 # Cells % CFSE Contrôle CFSE Test

67 Des questions?