Méthodes d étude de l activité des antibiotiques

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1 DFGSP3 2017/2018 Méthodes d étude de l activité des antibiotiques Pr Hélène MARCHANDIN Introduction Sensibilité (S) et résistance (R) naturelles des espèces bactériennes à certains antibiotiques (ATB) = propre à toutes les souches d 1 genre ou d 1 espèce donnée Nombreux mécanismes de R acquise aux antibiotiques = propre à certaines souches d une espèce Etude in vitro de l activité des ATB sur bactéries pathogènes = Etape nécessaire au choix d une antibiothérapie adaptée 2 1

2 Nombre de bactéries/ml Interactions bactérie-antibiotique Ralentissement de la croissance Bactériostase CMI Bactéricidie CMB Effet létal de l antibiotique 3 Etude de la bactériostase = détermination de la CMI (concentration minimale inhibitrice) plus faible concentration d'antibiotique capable d'inhiber toute croissance visible de la bactérie in vitro En milieu liquide En milieu solide Dilution en milieu liquide - Méthodes manuelles (réf) - Méthodes automatisées Dilution en milieu gélosé (réf) Diffusion en milieu gélosé - Disques - Bandelettes (réf) : méthodes de référence méthodes utilisées en routine 4 2

3 Détermination CMI / DILUTION en milieu liquide Méthodes manuelles Inoculum bactérien standardisé (sans ATB) Gamme de concentration d ATB de raison Croissance bactérienne Exemple 6 3

4 Microméthodes - en microplaques T Gamme d ATB(s) Etude d un ou plusieurs : - ATB - isolats bactériens par plaque Exemple Souche d E. coli et amoxicilline T µg/ml CMI 64µg/ml 7 - méthodes automatisées cartes / micro-puits : antibiotiques à concentrations incubation, lecture de la croissance bactérienne et interprétation automatisées méthodes plus rapides : environ 6-7h 8 4

5 Détermination CMI / DILUTION en milieu gélosé Gamme de concentration d ATB + inoculum bactérien standardisé (spot) T 0,5 1 2 µg/ml Souches 1 et 4 : CMI = > 2 µg/ml Souche 2 : CMI = 2 µg/ml ; souche 3 : CMI = 1 µg/ml 9 Détermination CMI / DIFFUSION en milieu gélosé Méthode des disques Inoculum standardisé 0,5 McFarland 10 8 UFC/ml Milieu de Mueller-Hinton Lecture d un diamètre d inhibition (en mm) 10 5

6 Correspondance avec la CMI Courbes de concordance diamètre d inhibition CMI pour chaque ATB Antibiotique X 11 Evaluation de la CMI par bandelettes Gradient continu d ATB sur bandelette Ex : Méthode Etest Ellipse d inhibition CMI de vancomycine 12 mg/l Lecture directe de la CMI : intersection bandelette - croissance bactérienne CMI de teicoplanine 1 mg/l 12 6

7 L antibiogramme - Détermination de la sensibilité d une souche bactérienne à un ou plusieurs antibiotiques - Antibiotiques à tester : Choix selon : le type bactérien (cocci ou bacilles à Gram + ou -) le spectre des ATB Nombre variable ( 30 : entérobactéries en milieu hospitalier) réponse au clinicien : interprétation en termes de d activité 13 Interprétation Classement des souches bactériennes en Sensibles (S) Intermédiaires (I) Résistantes (R) vis-à-vis d un antibiotique donné Définition de la résistance - 1 Une bactérie est dite résistante à un antibiotique si elle est capable de se multiplier en présence d'une concentration de cet ATB supérieure à celle que l'on peut atteindre in vivo 14 7

8 catégories thérapeutiques ou cliniques sensibles : bactéries dont la CMI est inférieure aux concentrations sériques obtenues avec posologies usuelles (c) forte probabilité de succès thérapeutique lors d un traitement par voie systémique avec la posologie recommandée résistantes : bactéries dont la CMI est > aux taux les plus élevés (C) forte probabilité d échec thérapeutique intermédiaires : bactéries dont la CMI est comprise entre c et C succès thérapeutique imprévisible 15 Ø en mm CMI en mg/l D < d Ex : S I R Ex : 4 8 c > C Concentrations sériques c C CMI critiques et diamètre critiques (= seuils) déterminés pour chaque ATB 16 8

9 Exemple : Entérobactéries et pénicillines 17 Interprétation de l antibiogramme : 3 niveaux 1- Interprétation des diamètres d inhibition ou des CMIs selon valeurs critiques + Réponse doit aussi tenir compte de l identification 2 de l espèce bactérienne et de ses R naturelles 3 du (des) mécanisme(s) de résistance acquise détecté(s) = LECTURE INTERPRETATIVE de l antibiogramme 18 9

10 Exemple 1 : Klebsiella Pénicillinase naturelle (groupe 2 des EB) Résistances naturelles 19 Exemple 2 : Enterobacter - céphalosporinase naturelle (groupe 3 EB) Résistances naturelles (β-lactamines) Résultats interprétés R quels que soient les Ø d inhibition observés 20 10

11 22/01/18 Exemple 3 : Staphylococcus et production de pénicillinase (R acquise) c) Ø > 26 mm Bordure floue S Ø > 26 mm Bordure nette Ø < 26 mm R R Lecture interpré-tative Seuil 26 mm + aspect de la bordure 21 Exemple 4 : Staphylococcus aureus méticillino-résistant (R acquise) Méticillino-résistance (PLP additionnelle) : - détection par disque de céfoxitine - seuil : S. aureus (22 mm) si R Lecture interprétative Interprétation : résistance à toutes les β-lactamines sauf ceftaroline et ceftobiprole 22 11

12 Définition de la résistance - 2 Une bactérie est dite résistante à un ATB si elle peut se développer à une concentration d ATB notablement plus élevée que celle qui inhibe la croissance de la majorité des souches de la même espèce catégories de population habituellement sensibles modérément sensibles inconstamment sensibles résistantes Variables : - selon l'espèce étudiée - dans le temps en fonction des antibiotiques (récents ou utilisés depuis longtemps) et selon les souches bactériennes (hospitalières / communautaires) 23 Exemple : érythromycine (macrolides) Habituellement sensibles Modérément sensibles Inconstamment sensibles Résistant spectre naturel d activité des ATB (cf Vidal) base des antibiothérapies probabilistes 24 12

13 spectre d activité des ATB (cf Vidal) - Exemple

14 base des antibiothérapies probabilistes - Prescription d'antibiotique(s) réalisée avant que ne soient connues la nature et/ou la sensibilité du ou des micro-organismes responsables de l'infection - Stratégie de probabilité du meilleur choix de l antibiotique basée sur données : épidémiologiques : espèces les plus impliquées dans le type d infection considéré bactériologiques : % de résistance dans ces espèces + cliniques, pharmacologiques (biodisponibilité,...) 27 Etude de la bactéricidie = détermination de la CMB (concentration minimale bactéricide) plus faible concentration d'antibiotique 0,01% de survivants Gamme de concentration d ATB de raison 2 + inoculum bactérien sans ATB 28 14

15 Dénombrement comparatif / à l inoculum bactérien initial T 0,01% de survivants si 100 colonies sur témoin Dénombrement à T1h, T2h,... cinétique de bactéricidie 29 Recherche de mécanismes de résistance particuliers Mécanismes de R de détection délicate Ex : Streptococcus pneumoniae de sensibilité diminuée (bas niveau de R) à la pénicilline (PSDP) Dépistage : Disque d oxacilline OXA 1 µg 20 mm (1 µg) CMI Pénicilline G PSDP si > 0,064 mg/l < 20 mm PSDP 30 15

16 Mise en évidence d une enzyme inactivatrice Ex 1 : Méthodes rapides de détection de la production de β-lactamase = test chromogénique Haemophilus Moraxella catarrhalis Disque de nitrocéfine (Cefinase ) (β-lactamine chromogène) Coloration rose si hydrolyse 31 Ex 2 : Restauration de l activité d 1 ATB en présence d un inhibiteur de l enzyme inactivatrice Différences de Ø ex : amoxicilline (AMX) -/ + acide clavulanique (AMC) (inhibiteur de β-lactamases) Ex : Mise en évidence de la production de pénicillinase AMC Ø > AMX 32 16

17 Images de synergie (dites en «bouchon de champagne») entre disque de C3G et disque contenant ac. clavulanique production de β-lactamase à spectre étendu (BLSE) mécanisme de multirésistance chez bacilles à Gram négatif AMC C3G Δr Diamètre en en présence de BLSE AUG CTX 30 mm Diamètre en l absence de BLSE AUG=AMC : amoxicilline+acide clavulanique C3G : céphalosporine de 3 ème génération, CTX : céfotaxime 33 Exemple : Antibiogramme de Klebsiella pneumoniae productrice de BLSE C3G : Résistances naturelles + R acquises (dont C3G) par production de BLSE Imipénème et céfoxitine S : ATB non hydrolysés par la BLSE 34 17

18 Mise en évidence d une cible insensible à l ATB Ex : technique immunologique / agglutination de particules sensibilisées par des AC spécifiques de la PLP2a (détecte aussi PLP2c) staphylocoque staphylocoque méticillino-résistant méticillino- + - sensible Mise en évidence du support génétique de la R Méthodes moléculaires T T- Nombreuses applications Ex : amplification par PCR du gène meca codant la PLP2a (idem mecc PLP2c) 35 Etude d autres paramètres Etude de l activité d associations d ATB : diverses méthodes Exemple Indifférence Synergie (A+B) > A + B Antagonisme (A+B) < A + B Addition 36 18

19 Dosage sériques du ou des ATB Méthodes chromatographiques ajustement des posologies (efficacité / toxicité) 37 ajustement des horaires d administration Optimiser le temps où concentration ATB > CMI 38 19

20 Conclusion Etude de l activité des ATB importante dans l instauration d un traitement antibiotique efficace +/- surveillance traitement Infection bactérienne antibiothérapie probabiliste Identification + ou? ajustement thérapeutique 39 20