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1 abc Ann Biol Clin 2008 ; 66 (6) : Comparaison de deux techniques Elisa pour l étude de la séroprévalence de l infection à herpes simplex 1 et 2 dans une maternité de la région parisienne Comparison of two ELISA tests to study the seroprevalence of herpes simplex 1 et 2 infection in a maternity near Paris doi: /abc J. Benharrosh 1 H. Dauphin 2 H. Porcheret 1 J.-F. Meritet 3 M.-C. Boulanger 2 L. Maisonneuve 1 1 Laboratoire de biologie, Hôpital Robert Ballanger, Aulnay-sous-Bois 2 Service de gynécologie-obstétrique, Hôpital Robert Ballanger, Aulnay-sous-Bois 3 Service de virologie, Groupe hospitalier Cochin Saint-Vincent-de-Paul, Paris Article reçu le 26 juin 2008, accepté le 12 septembre 2008 Résumé. Si le diagnostic d une infection génitale à herpes simplex est essentiellement clinique, une indication du sérodiagnostic est de dépister les femmes enceintes séronégatives, à risque d acquisition du virus au cours de la grossesse. Dans ce but, nous avons comparé deux tests Elisa (enzyme linked immunosorbent assay) type spécifiques : Test Captia IgG spécifiques anti- HSV-1 et anti-hsv-2 de Trinity Biotech, et Elisa IgG HerpesSelect 1et2de Focus Diagnostics distribué par Eurobio Courtaboeuf, France dans une population de 307 femmes enceintes, suivies à la maternité de l Hôpital Robert Ballanger. Les prévalences observées entre les deux tests ne sont pas statistiquement différentes (respectivement 86,64 % et 85,99 % pour HSV-1 et 17,59 % et 15,31 % pour HSV-2). Si la prévalence vis-à-vis du virus HSV-1 est supérieure à celle actuellement décrite pour cette population, celle du virus HSV-2 est tout à fait comparable à celle retrouvée dans les dernières études de cohorte. Mots clés : HSV-1, HSV-2, Elisa, prévalence, grossesse Abstract. The diagnosis of herpes simplex virus (HSV) genital infection is primarily clinical. The primary indication for serodiagnosis is to detect seronegativity in pregnant women at risk of acquiring the HSV virus during the course of their pregnancy. In this study, two ELISA tests were compared for the detection of HSV infection among a population of 307 pregnant women followed at the maternity of a community-based hospital in France (Robert Ballanger hospital in the Seine-Saint-Denis department). The two tests compared were: Test Captia anti-hsv-1 and anti-hsv-2 specifics IgG of Trinity Biotech and the ELISA IgG HerpesSelect 1 and 2 of FOCUS Diagnostics distributed by Eurobio Courtaboeuf, France. Results: both tests results were similar in terms of population prevalence for HSV-1 and HSV-2 infections (respectively 86.64% and 85.99% for HSV-1; 17.59% and 15.31% for HSV- 2). Whereas the prevalence of the HSV-1 virus was described in the literature as being superior to our current results, the prevalence of HSV-2 according to the results of both ELISA tests studied was similar to the one described in previous cohort studies. Key words: HSV-1, HSV-2, ELISA, prevalence, pregnancy Ann Biol Clin, vol. 66, n o 6, novembre-décembre

2 L herpès génital est une maladie virale dont l agent responsable est le virus herpès simplex type 1 (HSV-1) ou 2 (HSV-2). Il s agit d une infection sexuellement transmissible dont la séroprévalence est en augmentation constante dans les pays occidentaux [1]. La prévalence actuelle des infections herpétiques en France est de 67 % pour HSV-1 et 15 % pour HSV-2 [2, 3]. Le plus souvent bénigne, bien que pouvant être invalidante en cas de poussées fréquentes, sa gravité potentielle repose essentiellement sur le risque de transmission d HSV-1 ou HSV-2 à l accouchement, en cas d excrétion virale dans la filière génitale au moment du passage du nouveau-né. Le diagnostic d une infection herpétique est essentiellement clinique ; aisé lorsqu il existe une ulcération génitale, parfois plus difficile lorsque la symptomatologie est discrète ou atypique. Il nécessite alors d être confirmé par le diagnostic biologique. La culture virale, sur cellules permissives (cellules de rein de singe en lignées continues ou cellules diploïdes humaines) reste le diagnostic de référence pour établir le diagnostic d une infection herpétique génitale. Après 48 heures à quelques jours, le diagnostic est suspecté sur l effet cytopathique caractéristique puis confirmé par des anticorps monoclonaux spécifiques. Des techniques immunologiques permettent la détection des antigènes viraux (glycoprotéines virales) en quelques heures, directement à partir du liquide vésiculaire ou dans les cellules infectées. La détection du génome viral par amplification de l ADN viral est probablement une technique d avenir, bien qu il n existe encore à ce jour que peu de trousses diagnostiques disponibles sur le marché. La place du diagnostic sérologique est encore à préciser. Son utilisation est le plus souvent restreinte aux enquêtes épidémiologiques, au conseil des couples «cliniquement discordants» et éventuellement aux patients atteints de MST [4]. Cependant, une de ses indications potentielles serait de dépister les femmes enceintes séronégatives donc à risque de «primo-infection» au cours de la grossesse, en particulier en cas de couples séro-discordants. L utilisation de tests dits «type-spécifique» qui détectent les anticorps dirigés contre la glycoprotéine G1 spécifique de HSV-1 ou ceux dirigés contre la glycoprotéine G2 spécifique de HSV-2 est recommandée [5]. Nous avons comparé dans cette étude deux tests commercialisés recherchant les anticorps «types-spécifiques» : Test Captia IgG spécifiques anti-hsv-1 et anti-hsv-2 de Trinity Biotech, et Elisa IgG HerpesSelect 1et2de Focus Diagnostics distribué par Eurobio Courtaboeuf, France dans une population de femmes enceintes, un mois avant la date présumée de l accouchement. Matériels et méthodes Patientes Notre étude a porté sur une cohorte de 307 femmes adultes suivies entre juin et novembre 2007 (soit 1/4 des patientes suivies dans cette période) dans le Service de gynécologie-obstétrique de l Hôpital Robert Ballanger à partir du dernier trimestre de grossesse. Elle a reçu l aval du Comité local de protection des personnes, et le consentement écrit a été recueilli pour toutes les patientes incluses par les cliniciens qui participaient à l étude. Aucun refus n a été constaté par les gynécologues qui participaient à l étude. L âge moyen des patientes étudiées est de 29,45 ans (extrêmes : ans). L interrogatoire relevait systématiquement les antécédents cliniques d infection génitale à herpès. Les analyses ont été effectuées sur sérum décanté et conservé à -20 C. Réactifs Deux techniques Elisa : Test Captia IgG spécifiques anti-hsv1 et anti-hsv2 de Trinity Biotech et Elisa IgG HerpesSelect 1 et 2 de Focus Diagnostics distribué par Eurobio, utilisant des protéines recombinantes gg purifiées spécifiques de type ont été comparées pour rechercher les IgG spécifiques anti-hsv-1 et anti-hsv-2. Leurs caractéristiques techniques sont résumées dans le tableau 1. Pour l interprétation des résultats, un index ISR (immune status ratio) est défini. Cet index correspond soit au rapport de l absorbance de l échantillon à la longueur d onde λ de 450 nm, sur l absorbance de l étalon (λ = 450 nm) pondéré d un facteur de lot pour la trousse Captia IgG spécifiques anti-hsv-1 et anti-hsv-2 (Trinity Biotech), soit au rapport de l absorbance de l échantillon (λ = 450 nm) sur l absorbance du calibrateur de limite (λ = 450 nm) pour la trousse Elisa HerpesSelect 1 et 2 (Focus Diagnostics). Une valeur d index ISR > 1,10 (Trousse Focus Diagnostics) ou ISR 1,10 (Trousse Trinity Biotech) est présomptive de la présence d anticorps IgG anti-hsv-1 ou anti- HSV-2. Une valeur d index ISR < 0,90 (Trousse Focus Diagnostics) ou ISR 0,90 (Trousse Trinity Biotech) indique qu aucun anticorps IgG anti-hsv-1 ou anti-hsv-2 n a été détecté. Une valeur d index comprise entre 0,9 et 1,10 (Trousse Focus Diagnostics) ou entre 0,91 et 1,09 (Trousse Trinity Biotech) est contrôlée. Seules celles comprises dans ces fourchettes d index ont été, à deux reprises, considérées comme un résultat équivoque. 666 Ann Biol Clin, vol. 66, n o 6, novembre-décembre 2008

3 Séroprévalence de herpes simplex 1 et 2 Tableau 1. Caractéristiques techniques des deux trousses anti-hsv-1 ou 2 utilisées. Nom commercial Test Captia IgG spécifiques anti-hsv-1 ou 2 Elisa IgG HerpesSelect 1 ou 2 Fabricant Trinity Biotech Focus Diagnostics Distributeur Trinity Biotech Eurobio Dilution du sérum 1/21 1/101 Temps d incubation (sérum, conjugué, 75 min ( ) 105 min ( ) substrat, arrêt) Nombre de contrôles 3 3 Nombre de calibrateurs 3 3 Nombre de blanc réactif 1 1 Conjugué IgG de chèvre anti IgG humaine couplée à la peroxydase Anticorps de chèvre anti-igg humaine couplée à la peroxydase Substrat TMB/H TMB/H 2 O 2 Valeurs seuils 1,1 : Positif > 1,1 : Positif 0,9 : Négatif < 0,9 : Négatif 0,91-1,09 : Equivoque 0,9 et 1,1 : Equivoque Les tests sérologiques des patientes ainsi que ceux des contrôles et calibrateurs ont été réalisés manuellement selon les recommandations du fabricant. Les sérums discordants ont été testés par une troisième méthode, sur un automate d immunoanalyse (Liaison de DiaSorin) à l aide des trousses Liaison HSV-1 et Liaison HSV-2 IgG. Basées également sur l utilisation d antigènes recombinant gg1 et gg2, ces trousses détectent de façon spécifique les anticorps dirigés contre HSV-1 ou HSV-2. Les critères d interprétation sont les mêmes que ceux de la trousse Focus Diagnostics : sérologie positive si IRS supérieur à 1,1, négative si IRS inférieur à 0,9 et équivoque si comprise entre 0,9 et 1,1. Tests statistiques La signification statistique de la répartition des fréquences de séropositivité ou de séronégativité a été recherchée par un test de X 2. Résultats HSV-1 Dans cette étude, avec la trousse Elisa IgG HerpesSelect 1 (Focus technologies) la séroprévalence pour les infections herpétiques à HSV-1 est de 85,99 % (n = 264). Avec la trousse Elisa Captia IgG spécifiques anti-hsv 1 (Trinity Biotech), la séroprévalence est de 86,64 % (n = 266) (tableau 2). La différence de séroprévalence entre les deux tests utilisés n est pas significative (p < 0,05). La moyenne des index IRS obtenue diffère entre les deux techniques avec des index IRS plus élevés en moyenne avec la trousse HerpesSelect 1 (Focus Diagnosctics) sans conséquence sur l interprétation biologique. Tableau 2. Comparaison des séroprévalences obtenues pour les tests de détection des anticorps IgG anti-hsv-1, et anti-hsv-2 avec les deux trousses testées Trinity (Biotech) et HerpesSelect (Focus Diagnostics). Séroprévalence HSV-1 (nombre de patientes) Séroprévalence HSV-2 (nombre de patientes) Test Captia IgG spécifiques anti-hsv (Trinity Biotech) Elisa IgG HerpesSelect (Focus Diagnostics) 86,64 % (266) 85,99 % (264) 17,59 % (54) 15,31 % (47) Au total, 262 patientes sont retrouvées séropositives en HSV-1 dans les deux techniques, 38 séronégatives et une patiente est contrôlée indéterminée soit une concordance de 98,04 % entre les deux techniques utilisées (tableau 3). Deux patientes (176 et 247) ont une sérologie positive [IRS de1,97 et 1,79 (seuil > 1,1)] avec la trousse Herpes- Select 1 (Focus Diagnostics) et négative avec la technique Captia de Trinity Biotech [IRS de 0,24 et 0,72 (seuil 1,1)]. Une des deux patientes (176) présentait une sérologie positive en HSV-2 dans les deux techniques. Les résultats obtenus avec les trousses Liaison HSV-1 et HSV-2 IgG (DiaSorin) pour ces deux patientes confirment ceux obtenus avec les trousses HerpesSelect 1 et 2 (Focus Diagnostics). Inversement, quatre patientes (126, 160, 184 et 285) présentent une sérologie positive avec la trousse de Trinity Biotech (index 1,33 à 1,78 pour un seuil 1,1), alors qu elles sont séronégatives avec la technique distribuée par Focus Diagnostics (IRS 0,05 à 0,76). L étude de ces sérums par la trousse Liaison HSV-1 IgG (DiaSorin) pour ces quatre patientes confirment ceux obtenus avec les trousses HerpesSelect 1 (Focus Diagnostics). Ann Biol Clin, vol. 66, n o 6, novembre-décembre

4 Tableau 3. Comparaison des résultats obtenus pour la détection des anticorps IgG anti-hsv-1 chez les 307 patientes de la cohorte, avec les deux trousses testées HerpesSelect (Focus) et Trinity (Biotech). Sérologie HSV-1 Trousse HerpesSelect Trousse Trinity (ISR 0,9) (n = 40) (ISR 1,10) (n = 266) (0,9 < ISR < 1,10) (n = 1) (ISR < 0,9) (n = 42) (ISR > 1,10) (n = 264) (0,9 ISR 1,10) (n = 1) Tableau 4. Valeurs des IRS vis-à-vis des virus HSV-1 et 2 pour les six patientes discordantes en HSV-1. N sérum HerpesSelect HSV-1 0,76 0,25 1,97 0,05 1,79 0,06 Trinity HSV-1 1,78 1,62 0,24 1,33 0,72 1,47 Liaison HSV-1 IgG 7,2 <<0,50 43,7 <0,50 3,2 <<0,50 HerpesSelect HSV-2 0,1 0,1 2,2 0,16 0,16 0,04 Trinity HSV-2 0,47 0,23 3,04 0,42 0,3 1,88 Liaison HSV-2 IgG <0,50 <<0,50 3,1 <<0,50 <<0,50 <<0,50 Tableau 5. Comparaison des résultats obtenus pour la détection des anticorps IgG anti-hsv-2 chez les 307 patientes de la cohorte, avec les deux trousses testées HerpesSelect (Focus) et Test Captia (Trinity Biotech). Trousse HerpesSelect Sérologie HSV-2 Trousse Trinity (ISR 0,9) (n = 250) (ISR 1,10) (n = 54) (0,9 < ISR < 1,10) (n = 3) (ISR < 0,9) (n = 258) (ISR > 1,10) (n = 47) (0,9 ISR 1,10) (n = 2) La sérologie HSV-2 est négative (tableau 4) dans les trois techniques pour trois patientes ( et 184) et positive seulement avec la technique de Trinity Biotech pour une patiente (285). HSV-2 En ce qui concerne la détermination du statut sérologique pour HSV-2, les résultats ne sont pas statistiquement différents (p < 0,05) entre les deux trousses étudiées. En effet, la séroprévalence pour les infections à HSV-2 est de 17,59 % (n = 54) avec la trousse Elisa Captia IgG spécifiques anti-hsv-2 (Trinity Biotech) et de 15,31 % (n = 47) avec la trousse Elisa IgG HerpesSelect 2 (Focus Diagnostics) (tableau 2). 250 patientes sont séronégatives dans les deux trousses étudiées avec des moyennes d index équivalents (0,150 vs 0,142), 47 patientes sont séropositives et une patiente est contrôlée équivoque, soit une concordance de 97,07 % entre les deux techniques (tableau 5). Cependant, pour neuf patientes, les résultats sont divergents entre les deux trousses herpès type-spécifique testées dans cette étude. Cette divergence est confirmée par l étude des sérums par la trousse Liaison HSV-1 et HSV- 2 IgG (DiaSorin). Aucune d entre elles ne présentait d antécédent de lésion d herpès génital. En particulier, si l on exclut la patiente dont les index ISR sont très proches (1,07 vs 1,15), pour huit restantes (118, 166, 184, 200, 227, 230, 251 et 255), la sérologie est indiscutablement négative en trousse Elisa IgG HerpesSelect-2 (Focus Diagnostics) (index de 0,04 à 0,16) ainsi qu avec la trousse Liaison HSV-1 et HSV-2 IgG (DiaSorin), alors qu elle est équivoque ou positive en Elisa Captia IgG spécifiques anti-hsv 2 (Trinity Biotech) (index IRS de 0,94 à 2,88). Ces huit patientes ont par ailleurs une sérologie positive en HSV-1 avec la technique de Trinity Biotech, alors que seulement 7 sont séropositives (118, 166, 200, 227, 230, 251 et 255) avec la technique de Focus Diagnostics (tableau 6). 668 Ann Biol Clin, vol. 66, n o 6, novembre-décembre 2008

5 Séroprévalence de herpes simplex 1 et 2 Tableau 6. Valeurs des IRS vis-à-vis des virus HSV-1 et 2 pour les huit patientes discordantes en HSV-2. N sérum HerpesSelect HSV-2 0,06 0,14 0,04 0,16 0,03 0,09 0,06 0,13 Trinity HSV-2 0,99 0,94 1,88 1,22 1,25 2,88 2,14 1,27 Liaison HSV-2 IgG <<0,50 <<0,50 <<0,50 <<0,50 <<0,50 <0,50 <<0,50 <<0,50 HerpesSelect HSV-1 1,48 4,73 0,06 5,75 1,29 2,1 2,5 2,16 Trinity HSV-1 2,49 2,94 1,47 3,32 1,83 2,41 4,37 4,52 Liaison HSV-1 IgG 16 34,5 <0,5 47,1 15,1 55,1 41,5 40,4 Discussion L objectif de notre étude était de comparer deux trousses de détection des anticorps spécifiquement dirigés contre HSV-1 ou HSV-2, dans une population de 307 femmes enceintes, un mois avant terme. Les deux trousses étudiées sont comparables en ce qui concerne la praticabilité et la simplicité technique, bien que la trousse Elisa Captia IgG spécifiques anti- HSV-1 et 2 (Trinity Biotech) ait des temps d incubation plus courts que la trousse trousse Elisa IgG HerpesSelect 1 et 2 (Focus Diagnostics) (75 min vs 105 min). Les moyennes des index IRS obtenues pour les patientes immunisées vis-à-vis des virus HSV-1 ou HSV-2 sont plus élevées avec la trousse Elisa IgG HerpesSelect (Focus Diagnostics), alors qu elles sont peu différentes pour les patientes non immunisées. En ce qui concerne la séroprévalence des virus HSV-1 et HSV-2 dans la population que nous avons étudiée, les trousses donnent des résultats statistiquement équivalents, bien que l on puisse suspecter une moindre spécificité de la trousse Captia IgG spécifiques (Trinity Biotech), en particulier pour la détection des anticorps anti-hsv-2 (tableaux 7 et 8). La séroprévalence HSV-1 observée dans notre étude est supérieure à celle décrite en Elle est à mettre en rapport avec les origines ethniques diverses des patientes suivies (origine africaine = 56 %). En effet, la séroprévalence décrite en Afrique est nettement supérieure à celle des pays d Europe [6]. La prévalence du virus HSV-2 est conforme a celle décrite précédemment. Parmi les 47 patientes séropositives en HSV-2 dans les deux techniques, seules quatre patientes décrivaient des antécédents de lésions herpétiques génitales. Par ailleurs, 4 (8,5 %) patientes sont séropositives pour HSV-2, alors qu elles sont séronégatives pour HSV-1 dans les deux techniques testées. Aucune ne présentait à l interrogatoire d antécédent d herpès génital. Tableau 7. Statut sérologique HSV-1 et HSV-2 des 307 patientes [Trousse Captia (Trinity Biotech)]. Sérologie HSV-1 Trousse Trinity Biotech Sérologie HSV-2 (ISR 0,9) (ISR 1,10) (0,9 < ISR < 1,10) (ISR 0,9) (ISR 1,10) (0,9 < ISR < 1,10) Tableau 8. Statut sérologique HSV-1 et HSV-2 des 307 patientes [Trousse HerpesSelect (Focus diagnostics)]. Sérologie HSV-1 Trousse Focus Diagnostic Sérologie HSV-2 (ISR < 0,9) (ISR > 1,10) (0,9 ISR 1,10) (ISR < 0,9) (ISR > 1,10) (0,9 ISR 1,10) Ann Biol Clin, vol. 66, n o 6, novembre-décembre

6 Conclusion Le sérodiagnostic herpétique de type est parfois difficile en raison de la forte homologie des virus HSV-1 et 2 entraînant une forte réactivité croisée. L utilisation d antigènes recombinants purifiés permet de se soustraire à ces défauts de spécificité. Dans cette étude, nous avons voulu comparer deux techniques basées sur l utilisation de protéines recombinantes spécifiques de type, sur un panel de 307 patientes enceintes et prélevées au cours du troisième trimestre de grossesse. Notre étude permet de confirmer que deux tests «types spécifiques» HSV-1 et HSV-2 sont comparables dans la détermination du statut sérologique vis-à-vis de ces deux virus. Références 1. Aymard M. Epidémiologie actuelle de l herpès. Pathol Biol 2002 ; 50 : Pebody RG, Andrews N, Brown D, et al. The seroepidemiology of herpes simplex virus type 1 and 2 in Europe. Sex Transm Infect 2004 ; 80 : Malkin JE. Epidemiology of genital herpes simplex virus infection in developed countries. Herpes 2004 ; 11(Suppl.) : 2A-23A. 4. Ashley RL, Wald A. Genital herpes : review of the epidemic and potential use of type specific serology. Clin Microbiol Rev 1999 ; 12 : Arvaja M, Lehtinen M, Koskela P, et al. Serological evaluation of herpes simplex virus type 1 and type 2 infections in pregnancy. Sex Transm Infect 1999 ; 75 : Patnaik P, Herrero RA, Morrow A, et al. Type-specific seroprevalence of herpes simplex virus type 2 and associated risk factors in middle aged from 6 countries : the IARC multicentric study. Sex Transm Dis 2007 ; 34 : Ann Biol Clin, vol. 66, n o 6, novembre-décembre 2008

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