Les différentes stratégies de quantification :

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1 Les différentes stratégies de quantification : Ce chapitre présente les 2 principales stratégies de quantification relative utilisée classiquement : la méthode des droites standards et celle des Ct. Les modèles mathématiques à la base des méthodes sont détaillés. Une comparaison des 2 méthodes sur un exemple simple et leurs avantages et inconvénients respectifs sont présentés. Plus précisément, nous illustrons des exemples de biais introduits par la méthode des Ct si celle-ci est mal utilisée. Consultez la page WEB : voir Relative quantification 1 / Introduction Vous pouvez vous référer au Technical Note LC10/2000 de Roche. La PCR quantitative en temps réel s appuie sur des mesures faites pendant la phase dite exponentielle de la PCR. Les principes de la quantification par PCR en temps réel s appuient sur deux concepts de base différents : - la quantification absolue : en s appuyant sur des dilutions standards de concentration connue, la concentration absolue du gène cible est déterminée : ce type de quantification est utilisé pour déterminer le nombre absolu de particules infectieuses (virus, bactéries) dans des échantillons biologiques. On y distingue une quantification absolue faite avec et sans standards externes. - la quantification relative ou comparative : la concentration du gène cible est exprimée par rapport à un gène référence (obtenu à partir du même échantillon biologique) : pas besoin de standards de concentration connue. Cette méthode est recommandée pour les expressions de gènes et pour le dosage de gène. On y distingue une quantification relative s appuyant sur des courbes standards de calibration (méthode des droites standards) et l autre s appuyant sur les efficacités respectives des gènes référence et cible et les Cp obtenus pour les échantillons et le calibrateur, sans courbe de calibration (méthode des Ct). 2 / La quantification absolue : La concentration de la cible est exprimée en valeur absolue déterminée à partir du standard. Consultez la page WEB : voir Absolute quantification A l aide d un standard externe mais sans contrôle interne : Vous pouvez vous référer au Technical Note n LC11/2000 de Roche. Le standard externe permet de créer une courbe standard à partir duquel est calculée la concentration en molécules cibles des échantillons. L efficacité PCR doit être la même sur le standard ou sur les échantillons. A l aide d un standard externe mais avec contrôle interne : Vous pouvez vous référer au Technical note n LC12/2000 de Roche.

2 Le principe est identique à la méthode ci-dessus avec en plus un ARN synthétique, ajouté après l extraction de l échantillon pour contrôler d éventuels effets inhibiteurs de la PCR et donc éventuelle détection de faux négatifs. Les séquences de la cible sur ce contrôle interne et dans l échantillon biologique leur permet d être co-amplifiés avec le même couple d amorces. Cependant, la détection simultanée et la différenciation du contrôle interne et de l échantillon sont possibles à l aide de sondes d hybridation différentes. 3 / La quantification relative Vous pouvez vous référer au Technical Note LC13/2001 de Roche. Consultez surtout la page WEB : voir Relative quantification La quantification relative fait intervenir un gène de ménage (Housekeeping gene HKG) qui va servir de normalisateur : ce gène est en effet considéré comme stable dans le modèle présenté, il ne subira pas de changement d expression en fonction des conditions analysées. Ce gène de contrôle va permettre de compenser d éventuels biais de PCR provenant de : - variations dans la quantité et la qualité des échantillons - rendement d extraction différent entre échantillons - variations dans les erreurs de pipetage - variations d efficacité de RT La méthode des droites standard (quantification relative avec des standards externes) : Cette méthode nécessite l établissement d une droite standard par gène. Cette droite étalon va servir à quantifier les concentrations inconnues d échantillons biologiques à partir d échantillons standards (produit de PCR cloné ou non), passés en même temps que les échantillons inconnus. On va contrôler l efficacité PCR de chaque couple, déterminer une gamme de mesure pour chaque couple permettant de quantifier tous les échantillons. Concept général : Pour chaque échantillon, on va donc déterminer la concentration en gène cible (Ncible) et la concentration en gène de ménage (ou référence : Nréf) en s appuyant sur les droites standards de chaque gène (Si, bien sur, les efficacités PCR des gènes cible et de ménage sont différentes). On va normaliser la mesure du gène cible par celle du gène référence (Ncible / Nréference) pour chacun des échantillons. Le logiciel Data Analysis effectue automatiquement le calcul des concentrations de la cible et du gène référence. Le calcul du rapport cible/référence doit être fait manuellement ou en utilisant une feuille de calcul de type Excel.

3 Les critères de préparation d une courbe standard sont : - au moins 4 points pour créer la droite couvrant la gamme de concentration attendue de la cible. - pour des concentrations intermédiaires et fortes (Cp inférieur à 25 cycles pour la plupart des couples PCR), une seule détermination est nécessaire pour chaque dilution ; - pour quantifier de faibles concentrations (Cp a partir de cycles pour la plupart des couples), on doit dupliquer voire tripliquer les points de mesure pour améliorer la robustesse du calcul. L efficacité PCR du couple choisi doit être la même pour le standard et pour les échantillons. Si le standard est un plasmide et les échantillons des cdna, il peut être utile d effectuer le calcul de l efficacité sur une dilution de cdna afin de le vérifier. La méthode des Ct (quantification relative normalisée par un calibrateur) : L expression de gènes cibles et référence est fonction de l efficacité de la PCR et du Cp enregistré. Avec cette technique, pas besoin d une droite standard pour chaque run, il n est pas nécessaire de connaître la valeur absolue du nombre de copies des échantillons. Les résultats sont exprimés par un rapport cible/référence de chaque échantillon normalisé par le rapport cible/référence d un échantillon appelé calibrateur. Dans cette méthode, la précision du résultat dépend des efficacités de PCR des gènes cibles et référence. Ces 2 efficacités doivent être les plus proches l une de l autre. Si elles ne le sont pas : - Sans correction de cette différence d efficacité, le résultat obtenu sera approximatif (introduction de biais de calcul)

4 - la différence d efficacité peut être corrigée pour obtenir un résultat précis. La PCR est décrite par l équation suivante : N = N0 x E cp N : nombre de molécules au cycle Cp N0 : nombre initial de molécules E : efficacité de la PCR Cp : cycle seuil Principes : - dans une première étape, le rapport cible/référence pour chaque échantillon et l échantillon calibrateur est calculé. Les biais liés aux différences de qualités et quantités des échantillons sont éliminés (le biais est le même pour la cible et pour la référence et donc s annule). - Dans une seconde étape, le rapport obtenu pour chaque échantillon est divisé par le rapport obtenu pour l échantillon calibrateur. Les biais liés aux différences de sensibilité dans la détection du gène cible et référence vont alors s annuler. La normalisation par l échantillon calibrateur permet de comparer les échantillons entre eux. On pose : T (Target) pour gène Cible et R pour gène Référence. Au Cp respectif des 2 gènes, on a : NT = NT0 X E T C P T NR = NR0 X E R C P R On pose : S (Sample) pour échantillon et C pour Calibrateur (échantillon calibrateur). La méthode des Ct va calculer le rapport normalisé suivant : Rapport = N T(S) /N R(S) / N T(C) /N R(C) = K (S) / K (C) = 1 En effet, au Ct, le nombre de copies détectées des gènes cibles T et référence R ne sont pas tout a fait les mêmes. Par contre, le rapport K = N T / N R est constant et identique pour le calibrateur et l échantillon S. Autrement dit, sur la ligne de seuil placée sur les profils obtenus pour l échantillon calibrateur et pour l échantillon, le nombre de molécules de gènes cibles (ou de gène référence) est identique pour les 2 (même si bien sur les valeurs des Ct sont très différentes). Donc : K (S) / K (C) = 1

5 Equation 1 A/ Si l efficacité des 2 PCR est identique (E = E T = E R ), Le facteur R représente le facteur d expression du gène cible dans l échantillon par rapport à son expression dans le calibrateur. Rapport = E Ct = E CpT(C)-CpT(S)+CpR(S)-CpR(C) = E (CpT(C)- CpR(C)) (CpT(S)-CpR(S)) =E CtC- CtS Avec Ct = CpT-CpR La formule initiale de calcul était : 2 Ct Elle suppose que les 2 PCR cible et référence ont toutes deux une efficacité maximale de 100%. Il est important, pour valider cette méthode de quantification, de prouver que les efficacités de PCR de la cible et de la référence sont très proches. Un moyen de le prouver est de calculer les Ct en fonction des dilutions successives d un même échantillon. La valeur absolue de la pente Ct = f (dilution de l échantillon) doit être inférieure à 0,1. Une fois validée, on peut utiliser la méthode des Ct pour la quantification relative sans avoir à créer de courbes standards en parallèle. B/ Si les 2 efficacités sont différentes, le modèle mathématique peut s écrire :

6 C est une autre forme d expression de l équation 1 ci-dessus. C est la formule utilisée par le logiciel RealQuant de Roche lorsqu on tient compte des différences d efficacités entre les 2 PCR. Un logiciel appelé REST (Relative Expression Software Tool) va permettre de comparer non pas un échantillon contrôle vs un échantillon inconnu mais un groupe d échantillons contrôles vs un groupe d échantillons inconnus. 4 / Comparaison des 2 méthodes de quantification relative Pour illustrer l utilisation des 2 méthodes de quantification relative (droite standard et Ct) et montrer que ces 2 méthodes aboutissent aux mêmes résultats, on va prendre l exemple suivant : On va quantifier l expression du gène c-myc humain dans différents tissus (foie, poumon, cerveau, rein). Le gène référence choisi est la GAPDH. Le tissu calibrateur choisi arbitrairement est le cerveau. 1ère méthode : les droites standards On a établi à l aide de dilutions successives d un AN standard, une courbe standard pour chacun des 2 gènes. A partir de ces 2 courbes, on a pu établir le nombre de copies de chacun des 2 gènes dans chaque échantillon. On l a exprimé en «facteur de dilution du RNA standard» :

7 Tissu c-myc GAPDH c-myc / GAPDH c-myc / au cerveau Cerveau 0,039 0,54 0,07 1 Rein 0,41 1,02 0,40 5,5 Foie 0,7 0,28 2,49 34,2 Poumon 0,93 0,81 1,15 15,7 2 ème méthode : les Ct On a posé l hypothèse que chacune des 2 PCR est efficace à 100%. On note les Cp obtenus pour chaque gène dans chaque échantillon. Ct Ct = CpT-CpR Ct = CtC - CtS Tissu = C c-myc = T GAPDH = R Ct Ct c-myc / au cerveau Cerveau 30,39 23,63 6, Rein 27,03 22,66 4,37 2,5 5,6 Foie 26,25 24,6 1,65 5,21 37 Poumon 25,83 23,01 2,81 4,05 16,5 Toutes les variables comme les variations dans les quantités d échantillon par exemple, sont éliminées par la normalisation sur une référence par rapport à un échantillon calibrateur. On obtient des résultats identiques pour les 2 méthodes. Quelle méthode choisir? L utilisation de telle ou telle méthode est dépendante en fait de la précision exigée par vos mesures. Elle dépend de votre capacité à reproduire vos mesures, également des efficacités de vos PCR, des concentrations en molécules cibles de vos échantillons inconnus.

8 La quantification par le standard externe est la méthode la plus simple à mettre en œuvre. Une fois les primers optimisés, la droite standard doit être reproduite à chaque run de PCR. Elle peut également être sauvegardée et importée pour des runs ultérieurs. Mais dans ce cas, la précision des calculs peut en pâtir. En effet : - Dans le premier cas (droite refaite chaque fois), puisque standard et échantillons inconnus varient de la même façon, il est possible de détecter des variations d un facteur 2. - Dans le second cas (importation d une droite standard externe), des variations d un facteur 5 sont détectables mais plus difficilement d un facteur 2. Par contre, placer des échantillons standards sur chaque carrousel entraîne un surcoût et occupe des places prises sur les échantillons. Des droites standard de différents runs vont nécessairement présenter des variations. Ces variations dans la reproductibilité des expériences vont dépendre de certains facteurs : - Un nombre de point élevé dans la droite permettra d augmenter cette reproductibilité. - Le mode de conservation du standard doit être optimisé afin d éviter tout biais liés a son éventuelle dégradation. La quantification par les Ct va permettre de gagner de la place (de l argent également) en ne plaçant que des échantillons sur le carrousel. Si vous travaillez avec des efficacités de PCR cible et référence éloignées, vous pouvez introduire des biais importants (cf ci-dessous). Dans ce cas, il est possible d utiliser le logiciel RealQuant de Roche qui va tenir compte de ces différences pour quantifier précisément. Son utilisation exige en contre partie un formatage précis des expériences (cf le paragraphe RealQuant dans la seconde partie). Sinon il est possible d utiliser la formule décrite ci-dessus (cf 3 / B) sous Excell par exemple. 5 / Les biais introduits par la PCR attention au Ct Dans de très nombreux cas, une réaction PCR ne permet pas d amplifier avec une efficacité de PCR de 100% (par exemple, le pourcentage de GC contenu dans le produit amplifié intervient largement). La formule classique de la PCR (N = N0 X Eff n ) permet de calculer le nombre de molécules théoriquement obtenues pour des PCR présentant des efficacités différentes. Imaginons que l on parte d une seule molécule cible à l origine, on peut calculer en fonction d efficacité différente le nombre de molécules-filles générées au bout de n cycles en calculant (1+E) n : Cycles Eff 100% , , Eff 90% , Facteur écart 1,7 2 2,8 3,6 4,6 Eff 80% , Facteur écart 2,9 4,8 8,

9 On observe que plus la différence d efficacités entre les 2 PCR est grande, plus le facteur d écart entre l efficacité maximale et chacune des efficacités (et donc l erreur introduite) sera grand. Afin de bien comprendre les biais que peut introduire la méthode des Ct si elle n est pas contrôlée, nous avons choisi l exemple suivant : Un calibrateur et 6 échantillons présentent des rapports variables «gènes cibles sur gène référence». Le tableau 1 ci-dessous résume les nombres de copies de chaque gène. Gène ref Gène cible Qte de cibles dans l échantillon / calibrateur Calibrateur Ech A fois plus Ech B fois moins Ech C fois moins Ech D fois plus Ech E fois plus Ech F fois moins Ech G fois plus Ech H fois moins Ech I fois plus Ech J fois plus Ech K fois plus On pose l hypothèse que l efficacité PCR du gène référence (R) est de 100% et celle du gène cible (T) n est que de 80% (C pour Calibrateur et S pour Sample) En utilisant la formule : E T CpT(C)-CpT(S) X E R CpR(S)-CpR(C) Ct cible = CpT(C)-CpT(S) Ct ref = CpR(S)-CpR(C) On pose E T = 1,8 et E R = 2 avec les résultats de Cp suivants : Ref Target Ct cible Ct ref Ct Fact Calib 19,35 24,68 Ech A 19, , ,72 X50 Ech B 19,35 27,42-2,74 0 0,19 /5,26 Ech C 19,35 31,34-6,66 0 0,019 /52,63 Ech D 19,35 21,95 2,73 0 4,97 X4,97 Ech E 19,35 16,8 7, ,69 X102 Ech F 19,35 32,52-7,84 0 0,009 /111 Ech G 19,35 12,9 11, X1016 Ech H 19,35 36,4-11,72 0 0,001 /981 Ech I 19,35 17,7 6, ,5 X60,5 Ech J 19,35 15,65 9, X200 Ech K 19,35 11,75 12, X2000 Fact : facteur d expression du gène cible dans l échantillon par rapport au calibrateur.

10 Avec ce calcul précis, on obtient les «vrais» facteurs d expression des échantillons. On retrouve les valeurs théoriques énoncées dans le tableau 1. Si on est moins rigoureux et que l on se contente d utiliser la même valeur d efficacité (100% par exemple) pour les gènes cibles (= target) et référence : On pose E T = 2 et E R = 2 avec les mêmes valeurs de Cp, on obtient des résultats de facteurs d expression différents : Ct cible Ct ref Ct Fact Calib Ech A 6, X102 Ech B -2,74 0 0,15 /6,66 Ech C -6,66 0 0,01 /100 Ech D 2,73 0 6,63 X6,63 Ech E 7, X235 Ech F -7,84 0 0,004 /250 Ech G 11, X3517 Ech H -11,72 0 0,0003 /3333 Ech I 6, X126 Ech J 9, X522 Ech K 12, X7800 Si on compare les résultats obtenus avec les 2 méthodes (efficacités de 80% -correcte- et de 100% -moins précise- pour le gène cible ou target). Ainsi vraie valeur E T = 1,8 E T = 2 Facteur d écart Ech A 50 X50,72 X102 2 Ech B 5 /5,26 /6,66 1,2 Ech C 50 /52,63 /100 2 Ech D 5 X4,97 X6,63 1,3 Ech E 100 X102 X235 2,3 Ech F 100 /111 /250 2,5 Ech G 1000 X1016 X3517 3,5 Ech H 1000 /981 /3333 3,3 Ech I 60 X60,5 X126 2 Ech J 200 X202 X522 2,5 Ech K 2000 X1998 X7804 3,5 Si on compare les résultats obtenus entre les 2 méthodes, on observe : - Des écarts significatifs entre les deux avec des facteurs d écart entre 1,2 et 3,5 fois - Des facteurs d écart qui augmentent avec les valeurs relatives du gène cible dans l échantillon par rapport au calibrateur. Ainsi on obtient un facteur d écart de 1,2-1,3 pour une quantité de molécules cibles 5 fois plus et moins abondante dans les échantillons B et D ; on obtinet un facteur d écart de 3,5-3,3 pour une quantité de molécules cibles 1000 fois plus et moins abondante dans les échantillons G et H.

11 En ne tenant pas compte de l efficacité réelle de la cible, on estime mal la quantité relative du nombre de gènes cibles dans chaque échantillon. On perd également toute possibilité d information entre chaque échantillon : les échantillons G et K sont différents d un facteur 2 en tenant compte de l efficacité correcte et d un facteur 2,2 avec une estimation de cette efficacité. Si les efficacités des gènes cibles et référence sont différentes, on peut effectuer une quantification relative exacte (avec correction de la différence d efficacité) a l aide du logiciel RealQuant de Roche. 6 / La reproductibilité des mesures La reproductibilité des résultats est essentielle afin de valider les résultats obtenus. Elle dépend des efficacités de PCR, des concentrations de vos échantillons, de la qualité des échantillons biologiques (présence d inhibiteurs, défauts dans leur conservation) et bien sur de la qualité des pipetages. Elle est par contre indépendante du format de fluorescence utilisé. L efficacité de PCR est un facteur important pour la reproductibilité des résultats. Plus l efficacité PCR est grande, plus la PCR sera robuste, en particulier lorsque l on travaille avec des échantillons présentant un faible nombre de copies. La reproductibilité est directement dépendante de la concentration en cibles initiales. Plus cette dernière est forte, meilleure sera la reproductibilité. On observe ce phénomène en dupliquant les points de mesure et en calculant les cœfficients de variation obtenus sur ces mesures pour des dilutions successives. Exemple: sonde d hybridation, PCR de 131bp TNF alpha humain 6-4 réplicats par points de concentration Concentration initiale CV, Ct CV, conc copies 0,3% 5,1% 10 3 copies 0,4% 8,8% 10 2 copies 0,7% 16,5% 10 1 copies 1,7% 41% Le CV obtenu pour 10 copies est le plus élevé : a ces concentrations, les distributions statistiques jouent un grand rôle: ainsi, quand on pipette 10 copies par capillaires en moyenne, le nombre exact de copies dans le tube va de 7-13 (distribution de Poisson). A cause de ces distributions statistiques, on doit dupliquer ou tripliquer les points de mesure afin de pouvoir différencier 10 copies de 20 (plus que pour différencier 1000 de 2000). De manière générale, pensez a dupliquer vos points de mesure lorsque les Cp obtenus pour ces mesures se situent vers cycles, en particulier si votre efficacité PCR est moyenne. Le mode de conservation des échantillons biologiques (en particulier l échantillon standard utilisé régulièrement) est un élément important de la reproductibilité. Mal conservés (mauvaise température de conservation, trop faible concentration de conservation, cycles de

12 congélation-décongélation successifs), l échantillon va se dégrader au cours du temps et cela va introduire des biais entre expérience. La qualité des pipetages est bien sur une condition nécessaire à la reproductibilité des mesures. En particulier pour les plus faibles volumes (10 ul), un biais de pipetage même faible peut entraîner des erreurs. Assurez vous des «niveaux» de chaque capillaire avant de lancer votre carrousel. En pratique, a quoi peut on s attendre? Nous avons récoltés des données d une utilisatrice du département d endocrinologie (Jocelyne Leclerc) qui refait une gamme standard a chaque carrousel. Elle utilise une aliquote de son ADN standard, qu elle dilue extemporanément de 2 en 2, avec 5 points de gamme (nommés ici de 1 a 5). Les résultats obtenus (sur 27 expériences) sont les suivants : Gamme : Moyenne Cp 26,77 27,92 28,98 30,14 31,39 Ecart type 0,15 0,18 0,23 0,27 0,47 Ces résultats ne sont pas extrapolables a toutes les expériences bien sur, mais ils donnent un ordre d idée de l écart type que l on peut obtenir en travaillant dans des conditions «robustes» (standard concentré, aliquoté) dans des valeurs de Cp comprises entre 26 et 31. Si pour ces valeurs de Cp de cet ordre, l écart type des valeurs de Cp est très élevé, on peut se poser des questions quant a la capacité a reproduire des points expérimentaux avec ce couple. 7 / La précision des mesures : Un écart d un facteur 2 entre 2 échantillons en utilisant une PCR 100% efficace représente un écart d un cycle entre leur Ct respectif. De tels écarts ont été décrits sur le Light Cycler pour des applications de dosages de gènes par exemple. Mesurer un écart réduit (donc être le plus précis possible) suppose : - D utiliser des PCR efficaces, robustes et donc les plus reproductibles possibles (fragments courts par exemple). - De travailler dans des gammes de concentration en cibles élevés (Ct faibles, inférieurs à 25 cycles) afin d être le plus reproductible possible (voir 6 /) - De dupliquer les points de mesure afin d être plus précis. En particulier dans des gammes de concentrations en cibles plus faibles (Ct supérieur à 30 cycles). - D être capable de reproduire sur plusieurs jours les mêmes expériences. C est à ces conditions que vos mesures seront les plus précises.