PRINCIPES DE BASES DE L ANALYSE DES CHROMOSOMES HUMAINS
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- Maurice Sauvé
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1 PRINCIPES DE BASES DE L ANALYSE DES CHROMOSOMES HUMAINS II. Outils
2 CONTEXTE CLINIQUE Jonction entre chromosomique et moléculaire Dr G. Lefort
3 II. TECHNIQUE 1) Le caryotype conventionnel en bandes
4 Nécessite l obtention de cellules qui se divisent et que l on va bloquer en mitoses afin d obtenir les chromosomes à un stade de condensation maximum que l on pourra observer au microscope optique Inhibiteur de polymérisation Des microtubules : Colcemid (Molecular biology of the cell, Alberts)
5 Traitement des cellules Choc hypotonique : KCL 0,075M 37 Fixation : Méthanol/Acide Acétique
6 TEHNIQUE DU CARYOTYPE SANGUIN 1 Mise en culture 72H Milieu de culture + cellules en division : * Cellules sanguines (lymphocytes + mitogène : Phytohématoglutinine) 2 Colchicine : poison du fuseau mitotique. Bloque les cellules en mitoses 3 culot cellulaire Choc hypotonique et fixations 4 Etalement sur lame de verre 5 Tampon phosphate 85 + Giemsa (bandes R) Ou Traitement par la trypsine (bandes G) Observation au microscope Technique de bandes
7 Métaphase non classée au microscope
8 Les chromosomes en bandes Bandes R Dénaturation thermique Bandes G Digestion à la trypsine Idéogramme ISCN 2013
9 TECHNIQUE DES LIQUIDES AMNIOTIQUES Laboratoire de cytogénétique CHU de MONTPELLIER M PONSET M-C GUERIN
10 MISE EN CULTURE SUR LABTEK Réception du LA ( réparti dans 2 tubes coniques). Centrifuger le liquide 5 minutes à 1000 tours/minute. Aspirer le surnageant en laissant 0,5 ml au dessus du culot cellulaire. 4 Labtek 1 flacon
11 SORTIE DES LAMES Surveiller les lames au microscope inversé dès le 5 ème jour. Évaluer les critères de maturation de la culture cellulaire : Richesse de la lame, aspect et taille des clones, indice mitotique. Clone jeune Clone beau Ébauche
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13 RESULTATS Réalisation du caryotype complet : 12 à 25 clones (à partir de 2 à 3 lames) Résultats fiables sur liquides clairs et hémorragiques Possibilité de réaliser la FISH directement sur LABTEK
14 II. TECHNIQUE 2) L hybridation in situ fluorescente ou FISH
15 Hybridation in situ fluorescente FISH : Fluorescent in situ hybridization La FISH permet la visualisation d une séquence d ADN (la sonde) marquée par un fluorochrome, in situ après hybridation sur les chromosomes (la cible). L hybridation de la sonde et de la cible est possible en raison de la propriété de la double hélice d ADN de se dénaturer, et de se renaturer en hybridant les séquences complémentaires et de former un duplex sonde cible. La FISH permet l analyse des chromosomes en mitose et en interphase (noyaux interphasiques) et ne dépend pas de l obtention de bandes.
16 TECHNIQUE D HYBRIDATION IN SITU FLUORESCENTE Préparation des lames. Etalement des noyaux et chromosomes double brins Traitement à la pepsine Fixation à la formaldéhyde Dénaturation de l ADN par la formamide 70% 72 ADN simple brin Préparation de la sonde V V V V V V La sonde est en solution dans une solution d hybridation Contenant de la formamide et est dénaturée à 75 16
17 TECHNIQUE D HYBRIDATION IN SITU FLUORESCENTE Hybridation de la sonde simple brin sur l ADN de la lame Observation au microscope à fluorescence
18 Types de Sondes pour la FISH Sondes spécifiques des régions centromèriques qui vont s hybrider sur des séquences répétées en tandem sur plusieurs centaines de kb Enumération des chromosomes. Sondes spécifiques des régions subtélomèriques Diagnostic de translocation cryptique Sondes séquences uniques spécifiques de loci : Sondes commerciales pour les Syndromes microdélétionnels connus BACs (ou autres vecteurs Phage, YACs) marqués dans le laboratoire pour vérification des anomalies de CGH array Sondes de peinture chromosomique obtenues à partir de l amplification par DOP PCR de l ADN d un chromosomes entier obtenu à partir d hybride somatique ou par cytométrie de flux.
19 Sondes spécifiques des régions centromèriques qui vont s hybrider sur des séquences répétées en tandem sur plusieurs centaines de kb. Intérêt pour l énumération des chromosomes. Sondes centromèriques : Spécifique pour tous les chromosomes sauf 13 et 21 et 14 et 22. La FISH centromèrique est utilisée pour la caractérisation des anomalies de nombre.
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21 Sonde séquence unique : Sont utilisées pour le diagnostic de délétion cryptique (syndromes microdélétionnels)
22 Sondes de «peinture chromosomique» (whole chromosome painting : WCPs) obtenues à partir de l amplification par DOP PCR de l ADN d un chromosomes entier obtenu à partir d hybride somatique ou par cytométrie de flux. utilisées pour la caractérisation des anomalies de structure.
23 MultiFish ou FISH 24 couleurs
24 II. TECHNIQUE 3) Caryotype moléculaire ou Analyse chromosomique sur puce à ADN (ACPA) ou Microréseaux d ADN génomique CGH array (Comparative Genomic Hybridization)
25 Microarray Il existe différents type de miroarray ou «chips» De nombreuses utilisations en biologie moléculaire : Étude des profils d expression DNA méthylation Splicing mirnas Interaction protéines-adn (Chromatin ImmunoPrecipitation ) Etude des single nucleotide polymorphism : SNP Etude des Copy Number Variation : CNV (CGH array : Comparative Genomic Hybridization)
26 CGH ARRAY Etudie les CNV : Copy Number Variants La CGH array détecte les déséquilibres génomiques appelés CNV Un CNV correspond à une variation quantitative du génome en comparaison avec un génome de référence diploïde d 1 KB à plusieurs mégabases. Les variations du nombre de copies correspondent à des délétions, des duplications, des insertions, des remaniements complexes.
27 CGH ARRAY Etudie les CNV : Copy Number Variants Les CNV sont présents chez tous les individus et sont une traduction de la diversité génétique. Certains CNV sont retrouvés fréquemment au sein d une population donnée (>1%) et correspondent à un polymorphisme (CNP)
28 Hybridation comparative Technique d hybridation qui permet d analyser les anomalies chromosomiques déséquilibrées (gain ou perte) Réalisée à partir de l ADN à étudier + ADN témoin microarray : sondes sur lame de verre des milliers d oligonucléotides représentant tout le génome ADN à tester COHYBRIDATION R = V normal R > V gain ADN témoin R< V perte Mesure du ratio des fluorescence
29 Detection CNV : CGH array 10, 9 MB délétion 60 gènes 7.2 MB duplication
30 CGH ARRAY Difficultés pour établir le caractère pathogène d un CNV différents critères sont à établir: Caractère de novo ou hérité des parents : FISH des parents Taille : un remaniement de grande taille (plusieurs megabases) a plus de chance de contenir des gènes sensibles au dosage génique Type : une délétion est généralement plus délètère qu une duplication Contenu en gènes : établir si les gènes contenus dans la région sont associés à des syndromes connus Bases de données : DGV, DECIPHER, Génome Data Base,OMIM Données de la littérature
31 CGH ARRAY Les CNV diagnostiqués par CGH array doivent être vérifiés par une autre technique quantitative : FISH, QPCR sur le patient et chez les parents 3/4 délétions 1/4 duplications La CGHarray a permis l identification de nouveaux syndromes de microdélétions ou microduplications récurrentes la CGH array détecte en moyenne 10 à 20% d anomalie chez les patients ayant un décalage des acquisitions +/- malformations Pour effectuer le conseil génétique il est nécessaire de déterminer le mécanisme de l anomalie chromosomique Transmission sur un mode déséquilibré d un dérivé d une translocation cryptique parentale Ségrégation méiotique d une insertion parentale équilibrée Remaniement récurrent généré par recombinaison homologue non allélique
32 CGH ARRAY CNV bénin ou polymorphisme VOUS : Variant Of Unknown Signification CNV pathogène Pour effectuer le conseil génétique il est nécessaire de déterminer le mécanisme de l anomalie chromosomique Transmission sur un mode déséquilibré d un dérivé d une translocation cryptique parentale Ségrégation méiotique d une insertion parentale équilibrée Remaniement récurrent généré par recombinaison homologue non allélique
33 Algorythme inteprétation CGH array David Miller and al AM J Human Genet
34 II. TECHNIQUE 4) Séquençage Haut débit Next Generation Sequencing
35 NGS Permet le séquençage de millions de molécules d ADN simultanément après la préparation d une banque de fragments Les «reads» sont ensuite alignés sur un génome de référence Permet le diagnostic des anomalies moléculaires au niveau génique (mutations) mais aussi des anomalies chromosomiques : Délétion Duplication Inversion Insertion
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37 Intérêts/limites du caryotype standard Analyse pangénomique Permet le diagnostic des anomalies équilibrées Faible résolution : 5MB pour 55O Bandes 10 MB pour 400 bandes Difficultés d analyse de certaines régions chromosomiques en raison de la non discrimination des bandes Nécessite l obtention de cellules en culture Long et laborieux
38 Intérêts/limites de la FISH Réalisée sur métaphases et/ou noyaux interphasiques Ne nécessite pas l obtention de cellules en culture Permet de compter des centaines de métaphases et noyaux à la recherche d une faible mosaïque Résolution permettant le diagnostic des syndromes microdélétionnels Permet de confirmer une anomalie suspectée sur le caryotype standard Permet l analyse pantélomèrique Etude ciblée Ne permet l analyse que d un nombre limité de régions chromosomiques pour un patient (2 ou 3 sondes)
39 Intérêts/limites du caryotype moléculaire Analyse pangénomique Résolution A partir de l ADN même en faible quantité Ne diagnostique pas les anomalies équilibrées Difficultés pour les anomalies en mosaïque Difficultés d interprétation des CNV (copie number variation)
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