Détection des mycobactéries non tuberculeuses dans l eau*

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1 Détection des mycobactéries non tuberculeuses dans l eau* Françoise LUCAS, Nicolas RADOMSKI, CEREVE, Université Paris 12, Ecole Nationale des Ponts et Chaussés Laurent MOULIN, Sophie HAENN, CRECEP Laetitia BETELLI, Emmanuelle CAMBAU, Centre National de référence des mycobactéries et de la résistance aux antituberculeux * Les résultats présentés sont en cours de publication

2 Epidémiologie des infections à mycobactéries non tuberculeuses Habitat des mycobactéries atypiques : saprophytes de l environnement commensales transitoires (peau, muqueuses, tube digestif) Pathogènes opportunistes : Mycobactérioses Infections respiratoires, adénopathies, cutanées, ostéoarticulaires ou généralisée Incidence estimée à 0,5 à 2/ ha selon les pays environ 500 cas /an / France avec l épidémie de SIDA, Immunodépressions thérapeutiques (anti-tnf, corticoïdes), gestes invasifs (chirurgie, mésothérapie,...) Problèmes de diagnostic, de traitement et de prévention

3 Transmission des mycobactéries atypiques Pas de transmission interhumaine Voie de contamination? EAU Aérosols Consommation Contact / plaie Inoculation directe douches, eaux chaudes, arrosage boisson, lavage des aliments aquarium, baignade, poissons et coquillages (M. marinum*) iatrogènes et nosocomiales *Enquête CNR , Aubry et al. 2002

4 Présence des mycobactéries dans les eaux naturelles => Diversité et variation saisonnière Rio Grande, USA (Bland et al. (2005) M. fortuitum M. intracellulare M. scrofulaeum M. simiae M. kansasii M. gordonae M. avium M. malmoense ou marinum Non identifié autres espèces rares

5 Présence des mycobactéries dans l eau traitée (réseaux) Se multiplient dans les réseaux d eau de distribution d autant plus qu il est riche en matières organiques (Falkinham et al. 2001) Présentes dans le système de traitement et de distribution de l eau (Paris, Le Dantec et al. 2002) Résistent aux traitements de l eau comme le chlore ou l ozone (Falkinham et al. 2001; Le Dantec et al. 2002), d autant plus que l eau est riche en substances organiques non solubles (Steed and Falkinham 2006) De 1 UFC/L à UFC /L selon les études

6 Projet du groupe AQUAMYC Objectif : avoir des outils de Recherche des mycobactéries dans l eau Avec mesure de la quantité Permettant l identification des espèces présentes Fiables et reproductibles Stratégie : développer en parallèle deux méthodes Méthode de culture quantitative (sensible, référence) Détection par biologie moléculaire (rapide, spécifique)

7 1 Litre d eau Optimiser et standardiser les méthodes de dénombrement de mycobactéries par culture Concentration => 5 à 10 ml Filtration Centrifugation Culture lente (3 jours à 3 mois) Décontamination Isolement sur milieu riche milieux avec antibiotiques Éliminer les microbes autres que les mycobactéries (bactéries et moisissures) présents dans l eau

8 Matériel et Méthodes Echantillons d eau artificiellement contaminés = 1 L eau stérile inoculée de 10 2 à10 8 Mycobacterium chelonae (croissance rapide) pour apprécier la sensibilité de la méthode Pseudomonas aeruginosa jouant le rôle de flore interférente pour apprécier les techniques de décontamination Eau prélevée à partir du réseau de distribution ou de la Seine

9 Effet de la Filtration La filtration fait perdre une très grande quantité de mycobactéries : => entre 0 et 5 % seulement de récupération Pourcentages moyens de récupération des mycobactéries 54% = 18,7 Les traitements de la membrane avec SDS ou le Tween permettent de récupérer une partie des mycobactéries 1,4% = 1,35 Filtre Micropore 0,45 µm

10 Effet du traitement du filtre (décrochage des mycobactéries) Nombre d'ufc.10 4.l Sonication (min) Effet du temps de sonication UFC.10 4.l Plastique Verre SDS 0.2% SDS 0.4% Tween 80 1% Traitement Comparaison entre les différents traitements Avant ou après filtration

11 Concentration par centrifugation Centrifugation (3000xg/15 min) 150 T2 : filtration et décrochage au SDS T3 : filtration et décrochage désoxycholate T4 : filtration et dépôt directe sur milieu de culture Récupération (%) Concentration par centrifugation moins sensible mais plus reproductible que par filtration 0 P<0,0001 T1 T2 T3 T4 Traitement 57% 86%

12 Effet de la décontamination Bon effet décontaminant vis-à-vis des bactéries autres que les mycobactéries => Perte supplémentaire de 50% à 99% des mycobactéries Méthode de Löwenstein : H2SO4 Méthode de Petroff : NaOH Méthode de Tacquet-Tison : SLS- NaOH Méthode de Kubica : NaOH-NALC Méthode au (COOH)2 Méthode au CPC Pourcentage de perte d'ufc occasionnée par les traitements à l'acide sulfurique et au Cétylpyridinium (CPC) Mêmes résultats avec NaOH-NAC

13 Culture sur milieu contenant des antibiotiques 48 h SA avec ATB Prélèvements P1, P2, P3 7 j Eau de la Seine : présence de flore de contamination àprès culture sur 7H11 + PANTA + V Réduction de 2 à 3 Log bactéries SA Avec ATB Prélèvements P1, P2, P3 reproductible 14 j SA Avec ATB Prélèvements P1, P2, P3

14 Conclusion mise au point d une méthode standardisée de détection et de dénombrement des mycobactéries dans l eau Culture peu sensible quand protocole non approprié et décontamination (perte de 90 à 99%) Culture sur antibiotiques => perte moindre tout en gardant de la spécificité Sensibilité : environ 100 ufc/l Premières mesures dans l eau de réseau et de Seine : < 100 ufc/l à 1 million ufc /L Long et fastidieux => Développement nécessaire de la méthode moléculaire

15 Épidémies d infections à mycobactéries à croissance rapide cutanées chez immunocompétent Sur 20 rapports de 800 cas environ 114 M. abscessus / post-op 100 M. fortuitum / manucurie-pedicurie 205 M. abscessus / post-injection 14 M. chelonae / mesotherapie 32 M. abscessus / acupuncture 49 divers / mésothérapie 34 M. chelonae / liposuccion 16 cas en 2007 / Paris-mésothérapie En cours / France carboxythérapie (Huang 2000, Winthrop 2002)