Identification bactérienne par MALDI-TOF : Apport pour le patient
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- Monique Beaudet
- il y a 8 ans
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1 Identification bactérienne par MALDI-TOF : Apport pour le patient Sabrina Scellier, Etienne Carbonnelle HEGP 6 décembre 2013
2 Pr. A. Philippon De la galerie happy..à la spectrométrie de masse
3 Missions principales du laboratoire de microbiologie Identification des agents pathogènes Etude métabolique (tests biochimiques enzymatiques) Biologie moléculaire Sérologie Etude de la sensibilité aux anti-infectieux Antibiogramme (diffusion ou milieux liquides) Biologie moléculaire Recherche d un lien de clonalité, comparaison de souche Champs pulsé MLST Rep-PCR
4 Missions principales du laboratoire de microbiologie Exemples de systèmes commerciaux Identification des agents pathogènes Galerie Api, WalkAway, Vitek, Phoenix, GeneXpert (Cepheid) etc. MALDI-TOF-MS : opérationnel Etude de la sensibilité aux anti-infectieux WalkAway, Vitek, Phoenix, GeneXpert (Cepheid) MALDI-TOF-MS : en développement Recherche d un lien de clonalité, comparaison de souche DiversiLab MALDI-TOF-MS : en développement Liste non exhaustive
5 H24 : 2 minutes Tests phénotypiques Résistance Sérologie Autres BM Identification bactérienne H48 ou + Identification bactérienne, antibiogramme Antibiogramme
6 Exemple d identification bactérienne à partir de colonies entières Dépôt des échantillons Acquisition des spectres Analyse des spectres Banque de données Transfert des données au système informatique du laboratoire Identification A1 : Klebsiella pneumoniae A2 : Staphylococcus saprophyticus A3 : etc..
7 Spectromètres de masse Shimadzu Systèmes disponibles Andromas Bruker Andromas Biotyper (Anagnostec / BioMérieux ) Banque de données Identification bactérienne
8 Plan Spectrométrie de masse Applications à la microbiologie clinique Perspectives
9 Question 1 : Que signifie MALDI-TOF-MS? 1 : C est le slogan d une agence de voyage pour partir aux Maldives? 2 : Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time Of Flight Mass Spectrometry 3 : Je ne sais pas et j espère que le COFRAC ne me posera pas la question
10 Question 1 : Que signifie MALDI-TOF-MS? 1 : C est le slogan d une agence de voyage pour partir aux Maldives? 2 : Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time Of Flight Mass Spectrometry 3 : Je ne sais pas 3 : Je ne sais pas et j espère que le COFRAC ne me posera pas la question
11 Principe Transformer des molécules dans leur état naturel en ions à l état gazeux et obtenir leur masse moléculaire en analysant le rapport masse/charge (M/z) Nombreuses méthodes d ionisation des échantillons Choix de la technique d ionisation Nature de l échantillon Gaz / Solide / Liquide Composé volatil Composé thermolabile Type d analyse Elémentaire Structurale
12 Principaux types d ionisation Impact électronique ou électro-ionisation (EI) Ionisation chimique (CI) Photo-ionisation Electro Spray Ionization Ionisation-désorption Emission ionique secondaire (SIMS : Secondary Ion MS) Bombardement par des atomes rapides (FAB : Fast Atom Bombardment) Désorption plasma (PDMS : Plasma desorption MS) Désorption laser : (LDMS : Laser Desorption MS) (MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)
13 MALDI : Principe Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Utilisation d un faisceau laser pulsé dans l UV pour désorber et ioniser un mélange matrice/échantillon co-cristallisé sur une plaque métallique Photons laser Absorption des photons UV par les molécules de matrice Excitation puis ionisation de la matrice Relaxation de la matrice sous forme d énergie Dissociation de la matrice Passage en phase gazeuse dense Transfert de charge vers les molécules d échantillon
14 Expansion de la matrice à une vitesse super sonique Entraînement de l échantillon dans le nuage de matrice Transfert de charge vers les molécules d échantillon Echantillon ionisé majoritairement par transfert de protons
15 Expansion de la matrice à une vitesse super sonique Entraînement de l échantillon dans le nuage de matrice Transfert de charge vers les molécules d échantillon Echantillon ionisé majoritairement par transfert de protons MALDI : essentiellement des ions monochargés Mécanisme exact du processus MALDI?
16 MALDI-TOF Les ions formés en phase gazeuse sont accélérés par application d un champs électrostatique MALDI + analyseur de temps de vol = MALDI-TOF (TOF : Time Of Flight)
17 Source MALDI TOF Détection Irradiation laser Grille d extraction Cible métallique x Désorption Ionisation kv -20 kv Zone d accélération Zone de vol libre de champ Détecteur linéaire Analyseur TOF matrice analytes TOF : Time Of Flight Intensité relative m/z D après les feuillets de Biologie VOL N JUILLET 2010
18 Source MALDI TOF Détection Irradiation laser Grille d extraction Cible métallique x Désorption Ionisation kv -20 kv Acquisition du 6 décembre 2013
19 Source MALDI TOF Détection Irradiation laser Grille d extraction Cible métallique x Désorption Ionisation kv -20 kv Acquisition du 6 décembre 2013
20 Acquisition en temps réel
21 Le spectre obtenu en TOF est converti en spectre de masse par calibration avec des masses connues Temps de vol Masse Le TOF de chaque molécule est caractéristique de cette molécule
22
23 Matrices (1) Solubilité Capacité d absorption transfert de protons si affinité protonique de l accepteur (échantillon) est supérieure à celle du donneur (matrice) Capacité de co-cristallisation Stablilité Matrice en excès (1 pour 1000 matrice)
24 Question 2 : Identification bactérienne 1 : permet d identifier les micro-organismes dès la réalisation du prélèvement au lit du malade 2 : identifie avec certitude les E. coli et les shigella 3 : est la technique de référence pour l identification des pneumocoques 4 : permet d identifier correctement plus de 97% des bactéries isolées en routine
25 Question 2 : Identification bactérienne 1 : permet d identifier les micro-organismes dès la réalisation du prélèvement au lit du malade 2 : identifie avec certitude les E. coli et les shigella 3 : est la technique de référence pour l identification des pneumocoques 4 : permet d identifier correctement plus de 97% des bactéries isolées en routine
26 MALDI-TOF Application à la microbiologie Identification bactérienne
27 Empreintes spectrales obtenues à partir de colonies entières de cinq espèces bactériennes différentes (Matrice α-chca).
28 Empreintes spectrales obtenues à partir de colonies entières de 5 staphylocoques d espèces différentes (Matrice α-chca).
29 Constitution d empreintes spectrales pour 5 espèces bactériennes: Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, Shigella flexneri, Escherichia coli, Serratia marcescens Puis identification par analyse visuelle des spectres de souches de ces 5 espèces Méthode: Culture 24 h sur gélose Trypticase Soja Matrice CHCA Spectromètre: Vestec LaserTec Research Laser Nd-Yag 355 nm Résultats: identification d espèces possible à partir d un spectre de masse «spectral fingerprint» Différenciation d espèces proches comme Escherichia coli et Shigella flexneri
30 Espèces étudiées: Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus et Bacillus thurigiensis Préparation des échantillons: Etude des extraits protéiques (extraction chimique ou mécanique) Matrice: acide α-cyano-4-hydroxycinnamique ou acide sinapinique tirs lasers / échantillon Spectromètre: Vestec 2000 MALDITOF (laser à N2 337nm)
31 Le problème 2005 : spectres de masses de 150 genres bactériens et plus de 400 espèces Conditions expérimentales Comment gérer toutes ces informations????
32 Stratégie Tests bactériologiques simples d orientation Gram Mobilité Catalase Oxydase Aspect des colonies etc.. Comparer le spectre de la souche à la database Famille bactérienne Temps de culture Milieux Ex : cocci à Gram positif catalase positive sur MH en 24h Ouvrir la database Micrococcaceae
33 Réalisation de la banque de données Souches de Référence pour chaque espèce (collections) 10 acquisitions dans les mêmes conditions de culture 1 Critère : Pics supérieurs à 10%
34 1 > 0,1
35 Réalisation de la banque de données Souches de Référence pour chaque espèce (collections) 10 acquisitions dans les mêmes conditions de culture 1 Critère : Pics supérieurs à 10% 2 Critère : Pics constants dans les 10 acquisitions
36 S. hominis hominis * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Pics constants > 0,1 * * * * * * * * * * * * ** * * * * ** * * * * ** * * * * ** * * * * * * * * ** * * * * * * * * * * * * **
37 Exemples : database MH24h MH48h SG24h S.aureus S.capitis capitis S.capitis ureolyticus S.caprae S.cohni cohni S.cohni urealyticum S.epidermidis 2196 (+/-2) 2234 (+/-2) 2284 (+/-2) 2302 (+/-2) 2323 (+/-2) 2342 (+/-2) 3005 (+/-2) 3043 (+/-2) 4526 (+/-2) 5509 (+/-2) 6893 (+/-2) 2611 (+/-2) 2642 (+/-2) 2664 (+/-2) 2681 (+/-2) 2908 (+/-2) 2947 (+/-2) 5099 (+/-3) 6713 (+/ (+/-3) 5137 (+/-3) 5235 (+/-3) 6713 (+/-4) 6751 (+/-4) 2642 (+/-1) 2665 (+/-1) 2681 (+/-1) 2959 (+/-1) 5215 (+/-3) 2194 (+/-2) 2217 (+/-2) 2233 (+/-2) 2282 (+/-2) 2302 (+/-3) 2340 (+/-3) 2680 (+/-3) 2719 (+/-3) 3004 (+/-3) 3042 (+/-3) 6891 (+/-4) 2446 (+/-2) 2610 (+/-2) 2642 (+/-2) 2664 (+/-2) 2680 (+/-2) 2702 (+/-2) 2719 (+/-2) 2908 (+/-2) 2946 (+/-1) 5071 (+/-2) 5098 (+/-2) 5136 (+/-3) 6713 (+/-4) 6748 (+/ (+/-2) 5041 (+/-3) 5082 (+/-3) 5098 (+/-2) 5120 (+/-2) 5136 (+/-2) 5235 (+/-3) 6713 (+/-4) 6752 (+/-4) 1004 (+/-2) 2553 (+/-2) 2641 (+/-2) 2664 (+/-2) 2680 (+/-2) 2702 (+/-2) 2718 (+/-2) 2740 (+/-2) 2920 (+/-2) 2954 (+/-5) 5214 (+/-2) 5252 (+/-3) 5215 (+/-3) 2680 (+/-2) 2074 (+/-1) 2097 (+/-1) 2113 (+/-1) 2690 (+/-1) 4481 (+/-2) 6567 (+/ (+/-1) 2098 (+/-1) 2114 (+/-1) 2136 (+/-2) 6079 (+/-3) 6541 (+/-4) 2836 (+/-4) 5340 (+/-2) 6682 (+/-4) 6720 (+/-4) 1370 (+/-2) 2073 (+/-2) 2096 (+/-2) 2112 (+/-1) 2135 (+/-1) 2401 (+/-1) 2689 (+/-1) 4480 (+/-0) 5817 (+/-1) 1357 (+/-1) 2074 (+/-1) 2097 (+/-1) 2114 (+/-1) 2135 (+/-2) 2153 (+/-1) 2441 (+/-1) 4895 (+/-2) 6079 (+/-3) 6118 (+/-3) 6540 (+/-4) 6579 (+/-4) 2256 (+/-1) 4102 (+/-4) 4478 (+/-4) 4938 (+/-5) 4979 (+/-5) 4996 (+/-4) 5017 (+/-4) 5035 (+/-5) 5132 (+/-4) 6890 (+/-7) 1696 (+/-2) 1788 (+/-2) 3007 (+/-2) 4307 (+/-2) 5035 (+/-2) 5510 (+/-2) 6892 (+/-2) 2613 (+/-2) 2645 (+/-2) 5101 (+/-2) 6715 (+/-2) 5084 (+/-2) 5100 (+/-2) 5122 (+/-2) 5139 (+/-2) 5236 (+/-2) 6715 (+/-2) 2921 (+/-2) 2956 (+/-3) 5016 (+/-2) 5216 (+/-2) 5254 (+/-2) 7050 (+/-2) 1095 (+/-2) 1118 (+/-2) 1132 (+/-2) 1146 (+/-2) 1416 (+/-2) 2077 (+/-3) 2115 (+/-3) 2181 (+/-3) 2192 (+/-2) 2406 (+/-2) 2077 (+/-2) 2115 (+/-2) 2406 (+/-3) 6080 (+/-2) 6118 (+/-2) 6542 (+/-2) 6580 (+/-2) 2738 (+/-2) 2882 (+/-3) 5341 (+/-2) 6684 (+/-2) SG48h 1785 (+/-2) 2682 (+/-2) 2976 (+/-2) 3005 (+/-2) 3041 (+/-3) 5512 (+/-3) 6825 (+/-5) 6896 (+/-5) 2446 (+/-3) 2483 (+/-2) 2611 (+/-3) 2908 (+/-3) 5100 (+/-4) 6716 (+/-6) 5100 (+/-3) 5138 (+/-3) 5236 (+/-3) 6717 (+/-5) 2554 (+/-2) 2920 (+/-2) 2957 (+/-3) 5017 (+/-3) 5217 (+/-4) 7052 (+/-6) 1003 (+/-3) 2073 (+/-1) 2096 (+/-1) 2112 (+/-2) 2401 (+/-3) 2440 (+/-2) 2688 (+/-2) 4457 (+/-3) 4484 (+/-2) 4910 (+/-2) 5821 (+/-4) 1318 (+/-2) 1442 (+/-3) 2075 (+/-3) 2098 (+/-3) 2114 (+/-2) 4898 (+/-3) 6083 (+/-4) 6545 (+/-4) 2485 (+/-2) 2735 (+/-3) 2845 (+/-3) 5340 (+/-3) 6685 (+/-5) 6821 (+/-4)
38 212 souches cliniques testées Species Strain Micrococcus luteus CIP A270 S. epidermidis 81 clinical isolates S. warneri CIP CIP clinical isolates S. xylosus CIP CIP S. intermedius CIP S. haemolyticus CIP clinical isolates S. saprophyticus subsp saprophyticus CIP T CIP S. saprophyticus subsp bovis CIP CIP S. saprophyticus spp * 6 clinical isolates S. lugdunensis CIP S. hominis subsp hominis CIP CIP S. hominis subsp novobiosepticus CIP T S. hominis spp * 10 clinical isolates S. capitis subsp capitis CIP S. capitis subsp ureolyticus CIP T S. caprae CIP T CIP S. pasteuri CIP T CIP CIP S. cohni subsp urealyticum CIP T CIP S. scheiferi subsp coagulans CIP S. sciuri subsp sciuri CIP 8162T CIP CIP S. aureus 68 clinical isolates
39 Utilisation en routine Laboratoires équipés de MALDI-TOF-MS Toutes les identifications - soit sur colonies - soit directement à partir de Prélèvements - Hémocultures - Urines -...
40 Organisation au quotidien à l HEGP Nombres de lits: 800 Regroupement avec Corentin Celton et Vaugirard 2 laboratoires regroupés en services traitant les 24H et les 48H 1 laboratoire J0
41 Notre équipement Bact alert 3D Sirscan 2000 Urised Maldi TOF
42 Le matériel
43 Le standard et la matrice Le standard: Souche d Escherichia coli + protéines Conservation une semaine au congélateur après reconstitution Permet une recalibration automatique de l automate Validation de la plaque acquise nécessaire en vue de l accréditation La matrice: permet la cristallisation du dépôt Conservation 48h à 1 semaine (selon fournisseur) au réfrigérateur
44 Utilisation en routine Souche de 24H Dépôt à partir d une colonie isolée Idéalement à partir d une gélose au sang
45 Enregistrement du projet
46 Insertion de la plaque de maldi TOF
47 Acquisition de la plaque
48 Résultat d une acquisition
49 Résultat d une acquisition
50 Utilisation en routine : sur colonies Carbonnelle et al, Réanimation 2012
51
52 Utilisation en routine : sur hémoculture et urine Carbonnelle et al, Réanimation 2012
53 Question 3 : Le MALDI-TOF 1 : permet de ne plus faire d antibiogramme car les Informations concernant la résistance sont dans le spectre 2 : permet de dire à EOH que les souches sont identiques et qu il est grand temps de prendre des mesures pour isoler le patient 3 : rend de vrais services aux patients
54 Persperctives Comparaison de souches Facteurs de virulence Autres.
55 Apport du MALDI-TOF dans la comparaison de bactéries? Intérêt de comparer des souches : évidence Pas si simple Diagnostic (commensalisme, infection) Epidémiologie Approche phénotypique Approche génotypique
56 Approche phénotypique Biotype Antibiotype Sérotype Lysotype Electrophorèse des protéines MLEE Approche génotypique Profil plasmidique Electrophorèse en champ pulsé RFLP Amplification génique Séquençage (MLST)
57 Analyse MALDI-TOF H1: S. epidermidis H2: S. epidermidis H3: S. epidermidis H4: S. warneri H5: S. epidermidis H6: S. epidermidis
58 JCM 2012, 50(7) A : Méropénème B : Témoin C : E. coli NDM-1 D : A. baumanii NDM A B C D 358,5 384,4 406,4 424,5
59 Conclusions Technique fiable, peu coûteuse Opérationnelle dans de nombreux laboratoires Mise à jours et optimisation des banques de données Améliorations nécessaires : Comparaison de souches Résistance Facteurs de virulence
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