TD Noyau, Chromatine, Chromosome, Caryotype (S. Delbecq)

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1 TD Noyau, Chromatine, Chromosome, Caryotype (S. Delbecq) N. Boulle Année

2 NOYAU Caractéristique des cellules eucaryotes Limité par l enveloppe nucléaire (2 membranes: interne et externe) - Contient presque la totalité de l information génétique (le génome nucléaire)

3 L enveloppe nucléaire: délimite le noyau chromatine Pollard TD, Earnshaw WC, Biologie Cellulaire, Ed Elsevier Microscopie électronique: 1ères études 1950

4 L enveloppe nucléaire Description: Enveloppe constituée de 2 membranes: - membrane externe: en continuité avec le RER - membrane interne - espace périnucléaire Membrane L espace périnucléaire Enveloppe nucléaire Membrane interne externe Réticulum Endoplasmique Espace en continuité avec la lumière du RE: - contenu similaire - stockage du calcium Lumière du RE Percée par les pores nucléaires Interface entre le cytosquelette (cytosol) et le nucléosquelette (nucléoplasme) Espace périnucléaire Pore nucléaire ribosome Lamina nucléaire

5 Exercice 1 Transport nucléo-cytoplasmique

6 Transport nucléo-cytoplasmique: Via les pores nucléaires - Pores nucléaires: seule voie de communication entre le noyau et le cytoplasme - Passage dans les 2 sens; notion de sélectivité - Passage de petites molécules, ions Protéines Molécules de taille variable! ARNm, ARNt, ARNr ribonucléoprotéines, particules ribosomales - Protéines constituant le pore nucléaire: les Nucléoporines (Nup) Nucléoporines (Nup) : ~ 30 connues ~ 450 protéines en tout (par pore)

7 Les pores nucléaires 16 bras radiaires (2x8) 16 filaments (8 cytosoliques et 8 filaments de cage) Remarque: Pore nucléaire Asymétrique, déformable

8 Structure 3D des pores nucléaires Microscopie electronique, cryofracture Fahrenkrog and Aebi; Nat Rev Mol Cell Biol 2003, 4: unités répétées

9 Les pores nucléaires notion de sélectivité

10 Les éléments du transport nucléo-cytoplasmique Transport à travers le pore nucléaire dans les 2 sens Élément transporté = cargo - Signaux d adressage sur la protéine (cargo) à transporter (NLS, NES, NRS) - Importines, exportines: Récepteurs de transport -Les Nucléoporines: Nucléoporines contenant des séquences répétées riches en phénylalanine / gly (30%): Domaine FG (Ex: motif FXFG) Séquences de reconnaissance pour les Importines / Exportines Interviennent dans le transport à travers le pore nucléaire sélectivité du pore! -Système Ran GTP / GDP orientation du transport à travers le pore

11 Les signaux d adressage nucléaires Signaux d adressage: se comportent de manière autonome! -NLS «classique» (Nuclear Localisation Signal), riche en aa basiques (K, R) -NES (Nuclear Exportation Signal) -NRS (Nuclear Retention Signal) Translocation des protéines cargo sous forme repliées ( mitochondrie / peroxysome) Masquage/démasquage des signaux d adressage par partenaires d interaction REM: 40% des protéines nucléaires n ont pas de NLS classique

12 Le système Ran orientation du transport NC Ran = GTPase Hydrolyse GAP Pi GAP: GTPase- Activating Protéin Ran GTP Ran GDP GTP GEF Echange GDP GEF: Guanine nucleotide Exchange Factor

13 Le système Ran Disposition asymétrique des régulateurs GEF et GAP de part et d autre de la membrane nucléaire: GEF / GAP noyau / cytosol Existence d un gradient Ran.GTP / Ran. GDP entre le noyau et le cytoplasme Ran GDP Ran GTP Cytosol Ran GDP Ran GTP Noyau

14 Gradient de Ran à travers l enveloppe nucléaire Cytosol GAP cytosolique GEF Noyau GEF nucléaire

15 Figure 1

16 QCM 1 Excitation - λ Emission - λ E = h c / λ

17 QCM 3 L importation : Nucléoporine

18 QCM 3 Les Nucléoporines avec domaine FG: exemple de Nup 153 Extrémité flexible Fixe importines / exportine Extrémité amino-terminale de la nucléoporine Nup 153 Extrémité C-terminale de la nucléoporine Nup 153 contenant le domaine FG Fahrenkrog and Aebi (october 2003) 4: 757

19 Exercice 1 Figures 2A et 2B

20 Méthodologies: production de protéines «recombinantes» Cellule eucaryote Bactérie ADN Protéine rec. Protéine rec. purifiée Lysat Western blot IP

21 Méthodologies: Interactions Antigène-Anticorps protéine TAG Anticorps anti-tag - TAG TAG = FLAG, Histidine6, GST - Western-blot Anticorps dirigé contre la protéine d intérêt Lysat (protéines) + Gel d électrophorèse Lysat (protéines) - Immuno-précipitation Billes de résine

22 Méthodologies: Interactions protéine-protéine - «Pull down» Protéines purifiées ou domaines protéiques - Immuno-précipitation Protéines produites dans la cellule

23 Figure 2A

24 Bactérie Figure 2A Cellules HEK293 purifiée CP Histidine6 (His) Importine α FLAG FLAG Anti-Histag Billes de résine CP His Importine α FLAG FLAG lysat

25 CP Figure 2A Cellules HEK293 Importine α (1 ou 2 ou 3 ou 4) FLAG Billes de résine FLAG lysat Westernblot anti FLAG Pull down Imp α? Imp α CP FLAG-impα + CP Billes de résine Western blot anti-histag / Western-blot anti FLAG

26 QCM 4 Figure 2A FLAG impα4 CP His Billes de résine

27 QCM 4 Le recyclage des importines : RanGTP exportine RanGAP RanGDP exportine Hydrolyse du GTP libération de imp. α Imp. α Imp. α cytosol nucléoplasme RanGTP exportine Imp. α! Imp. α a un signal NES export direct de l importine β Ran GTP sans exportine

28 Figure 2B

29 Cellules HEK293= co-expression Figure 2B Billes de résine IgG contrôle Importine α4 FLAG GFP CP lysat Westernblot anti FLAG (WB anti- GFP) Billes de résine Immunoprécipitation Anticorps anti-flag Billes de résine IP Western blot anti GFP

30 Figure 2B - Piste 4 GFP Anticorps anti-flag Billes de résine Importine α4 FLAG CP lysat Anticorps anti-flag Importine α4 FLAG FLAG Importine α4 FLAG Billes de résine Billes de résine Western blot anti GFP

31 QCM 5 Figure 2B Anti- GFP Anti- GFP Importine α4 FLAG Billes de résine

32 CP-GFP Figures 3A 3B

33 QCM 6 L exportation : RanGAP RanGTP exportine NES RanGDP exportine NES cytosol nucléoplasme RanGTP exportine RanGTP exportine exportine CRM1 Leptomycine (LMB) NES NES

34 Figures 3C Pull-down

35 Figure 3C GST CRM1 (exportine) Piste 2 Piste 3 Piste 4 Billes de résine Billes de résine GST Billes de résine GST CRM1 (exportine) (146 kda) GST (26 kda) + CP Histidine6 Pull-down CP Piste 1? Histidine6 Western blot anti His Western blot anti GST

36 QCM 7 Figures 3C Pull-down Billes de résine GST CRM1 (exportine) CP NES CRM1 (exportine) CP Histidine6

37 QCM 7 Conclusion Impα 4 NLS NH2 CP (30 kda) (protéine de capside du virus Chikungunya) COOH NES Exportine (CRM1) RanGTP exportine CP CP Impα 4 Impβ cytosol nucléoplasme RanGTP exportine CP Impα 4 Impβ RanGTP CP

38 Chromosomes - Caryotype

39 Obtention d un caryotype Culture cellulaire: cellules somatiques Division cellulaire lymphocytes, cellules foetales (amniocentèse, biopsies trophoblaste) (Cellules tumorales) Accumulation de cellules Synchronisation / blocage Colchicine Prométaphase ou métaphase Solution hypotonique Dispersion chromosomique Fixation, coloration

40 QCM 7 Obtention d un caryotype

41 Structure d un chromosome métaphasique Répétition 5 TTAGGG 3 sur 5-10 kpb Se raccourcit à chaque division Classement des chromosomes? - Taille - Position du centromère Ic= p/(p+q) - Bandes (G, R ) Observation après coloration Classement en 7 groupes (A à G)

42 Obtention d un caryotype Caryotypes: Classement d après la longueur et l index centromérique : 7 groupes de A >G métacentriques A B submétacentriques C acrocentriques D E F acrocentriques G C G

43 Coloration des chromosomes au Giemsa Nombre de bandes variable selon le degré de condensation de la chromatine - Bandes G: sombres, digestion enzymatique ménagée + Giemsa - Bandes R: sombres, digestion thermique ménagée + Giemsa Bandes: Caractéristiques d une paire chromosomique Reproductible d une mitose à l autre Caractéristique d une espèce donnée Métaphase: bandes Caryotype standard = bandes (résolution 5-10 Mpb)

44

45 FISH: Hybridation In Situ Fluorescente Hybridation moléculaire (sondes ADN/ARN) Les différents types de sonde + Ne nécessite pas de cellules en division (noyaux en métaphase ou interphase) Bonne résolution Outil de recherche - Etude ciblée (sonde spécifique)

46 Cytogénétique moléculaire: FISH: Fluorescent in situ hybridization:

47 Les anomalies chromosomiques - Constitutionnelle (l'ensemble de l'individu porte la même anomalie) ou acquise - Équilibrée (il n'y a ni perte ni gain de matériel génétique) ou déséquilibrée - Homogène (toutes les cellules ) ou en mosaïque (certaines cellules) Anomalies du degré de ploïdie Ex: 69, XXX Anomalies de nombre : 2n +/- 1,2,3 Exemple: 47, XY, +21

48 Exercice 2

49 Exercice 2 der(11)t(1; 11)(q41; p15.5) Figure 1 : Caryotype classique (bandes G) de la mère (A) et du patient (B)

50 QCM 8 Régions NOR NOR = - Coloration spéciale (nitrate d argent) - Constrictions secondaires au niveau des chromosomes acrocentriques - Centre fibrillaire des nucléoles

51 QCM 8 N = 5 chromosomes acrocentriques x 2 = 10 régions NOR Réparties sur plusieurs nucléoles Constrictions secondaires Région NOR Possibilité de translocations robertsoniennes: fusion centrique des chromosomes acrocentriques

52 QCM 8 Régions NOR - Le nucléole Organisation des gènes en tandem (environ 20 copies) NOR (organisateur nucléolaire) ADNr ADNr ADNr ADNr ARN Polymérase I ARNr 45S + protéines = Grande particule RNP Clivage / maturation de l ARN Cf cours sur la transcription (UE1) Petite sous-unité ribosomale (40S) (Polymérase III) Grande sous-unité ribosomale (60S)

53 QCM 8 En Microscopie électronique (MET) - Centre fibrillaire (1 ou pls) Localisation des NOR - Composant fibrillaire dense (grande particule RNP) - Région périphérique granulaire (pré-ribosomes)

54 Exercice 2 Figure 2 Hybridation Génomique Comparative CGH : Comparative Genomic Hybridization Préparation de l ADN Hybridation sur support contenant les sondes («puce») Acquisition des signaux d hybridation 1 point = 1 sonde Analyse quantitative des données

55 Hybridation Génomique Comparative CGH : Comparative Genomic Hybridization Plus résolutif qu un caryotype classique : cf nombre de sondes sur le support Mais on ne voit pas les chromosomes Anomalie équilibrée?

56 QCM 9 Figure 2 : analyse par hybridation génomique comparative (array CGH) des chromosomes 1 (A) et 11 (B) centromère Numérotation des bandes centromère 11p11 Position approximative des centromères et de la région 11p11?

57 QCM Figure 3 : Analyses par hybridation in situ (FISH). A : sondes 1q43 (rouge) et 1p13.2 (vert). B : sondes 11p15.5 (rouge) et 11p p11.12 (vert). L ADN est visualisé à l aide de DAPI (bleu).

58 QCM Figure 2 : analyse par hybridation génomique comparative (array CGH) des chromosomes 1 et 11 Sondes utilisées pour la figure 3A (rouge) et 3B (bleu) centromère sonde 1p13.2 Sonde 1q43 centromère Sonde 11p p11 Sonde 11p11.11 NB: Position approximative des centromères et de la région 11p11

59 Chromosome 1 Conclusion Mère Chromosome 11 11p 1q Translocation réciproque entre les chromosomes 1 et 11: t(1; 11)(q41; p15.5)

60 1 mère 11 gamètes père 1 11 Fille Patient