Nom du laboratoire : Institut Biologie du développement et cancer. Descriptif de la thématique de recherche (sans aucun caractère confidentiel) :

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1 Nom du laboratoire : Institut Biologie du développement et cancer Ville et code postal : Nice Numéro de reconnaissance : UMR 6543 Etablissement d appartenance : CNRS. Candidat déjà sélectionné : OUI x NON Descriptif de la thématique de recherche (sans aucun caractère confidentiel) : Des mutations de l oncogène RAS sont connues de longue date comme étant prédominantes dans de nombreux cancers. Ces mutations entrainent l activation constitutive de la voie de signalisation RAF/MEK/ERK essentielle aux mécanismes de prolifération cellulaire. Cette voie de signalisation contrôle également les processus d angiogenèse tumorale permettant une vascularisation optimale des tumeurs donc leur développement et leurs capacités métastatiques. Il est également établi que le maintien d une longueur optimale des télomères est un facteur essentiel des cellules tumorales les empêchant de rentrer en phase de sénescence. Si l enzyme télomérase est un élément essentiel de ce processus, les protéines de liaison aux télomères composant le complexe «shelterin» jouent également un rôle majeur. La protéine TRF2 est un membre important de ce complexe protéique. Nous avons mis en évidence que la protéine TRF2 est un substrat des kinases ERK et que la simple mutation du site de phosphorylation par ERK de TRF2 bloque les cellules en phase G1 du cycle cellulaire. Cette phosphorylation est donc essentielle à l activité de TRF2. Nous avons développé des anticorps reconnaissant de manière spécifique ce site de phosphorylation permettant potentiellement d identifier des tumeurs hautement agressives. Un brevet a été déposé sur ces anticorps. Curieusement, l expression de protéines TRF2 mutées en des formes non phosphorylables bloque le potentiel angiogéniques de cellules transformées par l oncogène RAS. Cette thématique met donc en évidence des liens moléculaires très originaux entre différentes thématiques de recherche que sont les mécanismes de signalisation, l angiogenèse tumorale et la régulation de la longueur des télomères. Le projet consiste donc à comprendre : 1- les mécanismes moléculaires associés au contrôle de l angiogenèse via des protéines télomériques qui dans un contexte de cellules normales ne peut se fixer qu aux télomères 2- déterminer les cibles nos conventionnelles de TRF2 pouvant contrôler l angiogenèse 3- Déterminer le potentiel de nos anticorps dirigés contre les formes phosphorylées de TRF2 à servir de «détecteurs» de tumeurs très agressives. Secteur d activité recherché : 01. AGRICULTURE 07. MATERIEL ELECTRIQUE 02. ARMES - NAVAL - AERONAUTIQUE 08. MATIERES PLASTIQUES - PAPIERS - TEXTILES 03. B.T.P. 09. METALLURGIE - MINERAIS 04. CHIMIE ET PARACHIMIE 10. SERVICES 05. CONSTRUCTIONS MECANIQUES 11. TRANSPORTS - TELECOM 06. ENERGIE x12. AUTRES Date de démarrage souhaitée : Janvier 2012 Contact mail : gpages@unice.fr

2 Rôle conventionnel et non-conventionnel de la protéine télomérique TRF2 dans le cancer A. INTRODUCTION Les organismes eucaryotes ont la particularité d avoir des chromosomes linéaires. Leurs extrémités sont ainsi susceptibles d être reconnues comme des cassures double-brin de l ADN entraînant l activation des voies de réponses aux dommages de l ADN (DDR). Cette activation de la DDR à l extrémité des chromosomes aurait des effets désastreux sur la croissance et la survie des cellules. Les télomères résolvent ce problème de protection grâce à un complexe de protéines se liant aux télomères (complexe «Shelterin») et à leur structure particulière (t-loop) qui vont leur permettre de bloquer les mécanismes de réparation des dommages de l ADN. Cependant à chaque réplication, l ADN subit une perte de plusieurs dizaines de nucléotides au niveau de l extrémité 3 du chromosome qui aboutit à une entrée des cellules dans une étape finale de différenciation appelée sénescence réplicative. Les cellules immortelles ou cancéreuses possèdent un mécanisme permettant d éviter la perte critique des télomères. Le mécanisme de maintien de la longueur des télomères le plus fréquemment observé dans les cellules tumorales humaines est l activation de la télomérase 1. Elle permet de compenser l érosion des télomères lors de la prolifération cellulaire en ajoutant des séquences répétées TTAGGG à l extrémité 3 des télomères. La spécificité du complexe Shelterin pour l ADN télomérique est due à la reconnaissance des répétitions TTAGGG par trois de ses composants, dont le facteur télomérique TRF2 («Telomeric Repeat binding» Factor 2) qui se lie aux séquences double brin. La fixation sur l ADN se fait sous la forme d homo-dimères formés par l interaction des domaines TRFH de TRF2. Ce facteur est décrit comme jouant un rôle dans l inhibition de la fusion bout à bout de l extrémité des chromosomes et inhibant la DDR dépendante de la kinase ATM au niveau des télomères. van Steensel et al. 2 ont montré que l expression d un dominant négatif de la protéine télomérique TRF2 dans des cellules de fibrosarcomes humains induit un arrêt du cycle cellulaire avec des caractéristiques de sénescence. Takai et al. 3 démontrent que la sénescence induite par l expression du dominant négatif de TRF2 dans les fibroblastes humains est associée à l apparition de foyers contenant les facteurs de réponse aux dommages de l ADN tels que 53BP1, γh2ax et ATM au niveau des télomères. De plus, TRF2 est surexprimée dans de nombreux cancers humains 4-7. L équipe du Pr. E. Gilson a récemment montré que l expression d une forme constitutivement activée de la protéine Ras dans un contexte cellulaire où le complexe Shelterin est déstabilisé protège les télomères de la reconnaissance par la DDR et permet aux cellules de proliférer normalement (résultats en cours de publication). Ces résultats ont constitué le point de départ de notre collaboration avec cette équipe : nous avons émis l hypothèse que TRF2 est une cible directe de la voie des MAP Kinases ERK, hypothèse confortée par la présence d un site consensus de phosphorylation par ERK sur une sérine et de sites d interaction protéique avec ERK 8. Nous avons donc initié un projet visant à étudier le lien entre les ERKs et le facteur télomérique TRF2. B. PRINCIPAUX RESULTATS OBTENUS La protéine télomérique TRF2 est phosphorylée sur la sérine XXX (dépôt d un brevet en cours donc impossibilité de révéler le site exact) par les MAP Kinases ERKs in vivo dans des fibroblastes BJ-EHLT suite à une stimulation physiologique de la voie de signalisation ERK. Ces résultats ont été générés grâce au développement d un anticorps reconnaissant de manière spécifique les formes phosphorylées de TRF2 sur la sérine XXX. De plus, j ai démontré une phosphorylation constitutive de TRF2 sur la sérine XXX dans des lignées cellulaires cancéreuses présentant une activité ERK constitutive. La surexpression inductible par la tétracycline de TRF2 wt dans les cellules de mélanome A375 portant la mutation B-RAF V600E (activité ERK constitutive) n a pas d impact sur leur croissance in vitro. En revanche, l expression d une forme mutante de TRF2 portant une mutation de la sérine en un résidu alanine non phophorylable 1

3 (mutant TRF2 SXXXA ) diminue fortement la prolifération et la survie des cellules. J ai montré une activation de la DDR dans les cellules exprimant TRF2 SXXXA, DDR accompagnée d une induction de l apoptose et de la sénescence réplicative pour les quelques cellules survivant à l expression de TRF2 SXXXA. La phosphorylation de TRF2 par les ERKs semble donc jouer un rôle très important sur la stabilité du génome et les capacités prolifératives d une lignée de cellules de mélanome. C. DESCRIPTION DU PROJET AXE 1 : Rôle conventionnel du facteur télomérique TRF2 au niveau des télomères Objectif 1 : Effet de la phosphorylation sur la sérine XXX sur la stabilité de la protéine TRF2 Quand un télomère est déprotégé, les quantités et l activité de TRF2 diminuent résultant en l activation d ATM. ATM va induire l activation de p53 9 qui à son tour induit l expression de Siah1 10, une E3 ubiquitine ligase qui va ubiquitinyler et entraîner la dégradation de TRF2 par le protéasome. La diminution de Siah1 est un facteur pro-tumoral 11. Les niveaux de TRF2 vont diminuer ce qui va renforcer la déprotection des télomères. Cette boucle amplifie la voie de réponse de dommages à l ADN dépendante de p53 permettant ainsi une rapide induction de la sénescence ou de l apoptose 12. De part ce contrôle strict par Siah1, la demi-vie de la protéine TRF2 est inférieure à 4 heures 10 dans les fibroblastes primaires MRC- 5 mais augmente très nettement si les taux de Siah1 diminuent. Nous émettons l hypothèse que la phosphorylation de TRF2 par les ERK augmente sa stabilité relative comme démontré pour d autres substrats d ERK 13. a) La stabilité de TRF2 sera analysée dans une expérience d inhibition de la traduction par la cycloheximide ; i) dans des fibroblastes primaires MRC-5 et FHN ; ii) dans un contexte de fibroblastes BJ- HELT immortalisés en phase G0 du cycle cellulaire (activité ERK faible) ou après stimulation par des facteurs de croissance (activité ERK élevée) ; iii) dans un contexte de cellules cancéreuses (fibroblastes BJ-HELT immortalisés exprimant RasV12, cellules de mélanomes B-RafV600E, cellules cancers du sein sur-exprimant HER2, ) présentant une activité ERK constitutive. b) Le traitement des cellules avec un inhibiteur de MEK, le PD184352, active p53. En se basant sur le concept d une boucle de contrôle positive entre p53-siah1-trf2, TRF2 serait dégradée dans les cellules BJ HELT RasV12 lorsque MEK est inhibée. De plus, l inhibition de MEK entraîne une diminution de l activation d ERK et cela est corrélé à une diminution de la phosphorylation de TRF2 sur la sérine XXX. Des mesures du temps de demi-vie de TRF2 seront réalisées en absence ou présence de l inhibiteur de MEK dans des cellules normales stimulées par des facteurs de croissance et cancéreuses (ERK+++). Dans les différents contextes (cellules primaires, cellules immortalisées et cancéreuses), la dépendance du protéasome sera testée en présence ou absence d inhibiteurs pharmacologiques (MG132, LLnL, Lactacystine). Objectif 2 : Rôle de la phosphorylation de TRF2 dans son interaction avec les autres membres du complexe Shelterin Bloquer la capacité de liaison de TRF2 aux télomères semble modifier la stabilité du complexe Shelterin. Nous faisons l hypothèse que la mutation du seul résidu sérine XXX a les mêmes conséquences. Une des explications potentielles est la suivante : il est accepté que la phosphorylation d un substrat des ERKs dépende non seulement de la présence d un site consensus de phosphorylation mais aussi de la capacité de ce substrat à interagir directement avec la kinase. Les sites consensus d interaction décrits dans la littérature sont les domaines DEJL et DEF (domaine DEJL; K/RK/RK/R (X)4 à 5 L/IXL/I ou 2

4 K/RXK/RK/R (X)4-5 L/IXL/I et domaine DEF (FXFP) 14. Un site consensus d interaction d ERK avec TRF2 est présent entre les acides aminés 352 et 365 (KNKRMTISRLVLE). Une mutation du site de phosphorylation d un substrat stabilise son interaction avec les ERK. Or ce domaine consensus de liaison d ERK avec TRF2 est situé au niveau du domaine d interaction de TRF2 avec TIN2 15, une protéine essentielle du complexe Shelterin. Notre hypothèse de travail consiste donc à penser que l expression de formes TRF2 SXXXA stabilise une interaction TRF2/ERK, empêche la formation d un complexe Shelterin optimal et engendre une dé-protection des télomères semblable à celle rencontrée lors de l inhibition de l activité de TRF2. Des expériences essentielles consisteront à confirmer l importance de la phosphorylation de TRF2 sur l interaction TRF2/TIN2. Pour cela, des expériences de co-immunoprécipitation (co-ip) TRF2/TIN2 en présence ou en absence d inhibiteurs de MEK seront réalisées. Ces expériences seront réalisées sur des cellules normales stimulées par des facteurs de croissance pour évaluer cette interaction tout au long du cycle cellulaire. En parallèle, ces expériences de co-ip seront réalisées dans des cellules exprimant les formes sauvages ou mutantes de TRF2. Objectif 3 : Validation de la phosphorylation de TRF2 en tant que marqueur pronostique et marqueur prédictif de réponse à des drogues inhibant la voie de signalisation ERK Bien que la voie de signalisation ERK soit très souvent activée dans des tumeurs suite à la surexpression de récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK), de mutation de Ras ou de Raf ou de certaines translocations chromosomiques (BCR/Abl dans la leucémie myéloïde chronique), il n existe pas de corrélation entre activité ERK et survie des patients 16. De plus, si certains tissus développent des tumeurs avec une activité ERK élevée, des tumeurs d autres tissus ont une activité ERK faible 17. La détection de la phosphorylation d un substrat d ERK impliqué dans la prolifération pourrait donc avoir un rôle pronostique beaucoup plus pertinent. De plus, beaucoup de thérapies ciblées utilisées en clinique induisent une inhibition de la voie de signalisation ERK notamment des inhibiteurs de RTK ou des inhibiteurs de Raf. Cependant ces thérapies sont très coûteuses. Il est donc important de découvrir des marqueurs prédictifs de leur efficacité. Nous sommes en cours de mise au point de l utilisation de l anticorps dirigé contre la sérine XXX phosphorylée sur des coupes de tumeurs inclues en paraffine. Nous avons accès à un ensemble de bloc paraffine de tumeurs du sein HER2 +++ présentant une activité ERK constitutive. Ces blocs seront analysés pour la présence des formes phosphorylées de TRF2 et des formes totales. Nous corrélerons l intensité du signal de ptrf2 avec la survie des patients (dossiers cliniques informatisés du Centre Antoine Lacassagne collaboration Dr JM Ferrero (responsable tumeurs sein) et E Chamorey (études statistiques). Nous avons accès à des échantillons de tumeurs du sein dont la taille nécessite une chimiothérapie néo-adjuvante avant chirurgie. En collaboration avec les cliniciens du Centre nous auront accès à ces échantillons et testerons le rôle de la phosphorylation de TRF2 sur la sérine XXX comme marqueur prédictif de réponse à l Herceptine. Conclusion Ces expériences permettront de mettre en évidence un lien tout à fait original entre une voie de signalisation très souvent activée dans des tumeurs et un phénomène indispensable à la croissance cellulaire qui est la stabilisation des télomères. En plus des connaissances fondamentales, ce volet de l étude permettrait de mettre en évidence un nouveau marqueur pronostique d agressivité tumorale voire prédictif de réponse à des thérapies ciblées. 3

5 AXE 2 : Rôle non conventionnel de TRF2 : indépendance activité télomérique Objectif 1 : Effets de la surexpression de TRF2 et de ses formes mutées sur la tumorigenèse Des expériences de formation de tumeurs dans la souris menées au laboratoire indiquent que la surexpression de TRF2 confère un très fort avantage prolifératif aux tumeurs. Des résultats récents suggèrent que lors de sa surexpression, même si TRF2 se lie de manière attendue aux télomères, elle possède d autres cibles ADN voire ARN. Nous émettons donc l hypothèse que la dérégulation de l expression de TRF2 pourrait entraîner la mise en place d un programme d expression génique favorisant le développement tumoral de manière dépendante et non dépendante de sa fonction télomérique 18,19. L absence davantage prolifératif in vitro suggère que cet effet est dépendant, in vivo, d une interaction entre les cellules cancéreuses et le stroma de l hôte. De plus des données préliminaires suggèrent fortement que le facteur TRF2 modifie le profil angiogénique des cellules tumorales dans lesquelles il est surexprimé. Dans le but de vérifier cette hypothèse et de découvrir les acteurs moléculaires mis en jeu, nous mettrons en œuvre les compétences du laboratoire en matière d analyse de l angiogenèse tumorale pour : i) Comparer l expression de facteurs pro- et anti-angiogéniques dans le sécrétome des cellules contrôles et des cellules sur-exprimant TRF2 wt ; ii) Analyser la vascularisation des tumeurs formées avec ces mêmes cellules (concentration en hémoglobine, marquage des vaisseaux CD31). Nous étendrons ces études à des tumeurs exprimant les formes TRF2 SXXXA. Les résultats obtenus nous permettront d élucider le rôle de la surexpression de TRF2 dans l angiogenèse tumorale et de vérifier si ce rôle est dépendant de la phosphorylation de TRF2 par ERK ; iii) Démontrer que des drogues ciblant la voie ERK (Herceptine/Gefitinib/Erlotinib (inhibiteurs récepteurs EGF), Sorafenib/PLX4032 (deux inhibiteurs de B- Raf utilisées en clinique), Sunitinib (ciblage de RTK)) diminuent la phopshorylation de TRF2 et corrèle avec la réduction de la taille tumorale et l angiogenèse dans différents modèles expérimentaux de tumeurs. Objectif 2 : Rôle de TRF2 sur l épissage du pré ARNm VEGF vers ses formes proangiogéniques L un des facteurs essentiels à l angiogenèse est le VEGF. Il existe plusieurs isoformes du VEGF, dont la plus commune est la forme VEGF165 décrite comme pro-angiogéniques. Plus récemment, une nouvelle isoforme issu d un épissage alternatif au sein du dernier exon du gène a été identifiée, le VEGF165b. Ce dernier est décrit comme anti-angiogénique 20. L épissage alternatif du pré-arnm du VEGF génère donc deux protéines dont la partie C-terminale diffère de six acides aminés. En plus de la séquence protéique, la séquence des ARNm codant les formes pro et anti-angiogéniques différent de 44 bases. Ces 44 bases sont présentes dans l extrémité 3 non codante des formes pro-angiogéniques mais sont épissées et donc absentes des formes anti-angiogéniques. Cette séquence de 44 bases présente une organisation nucléotidique caractéristique des séquences capables d adopter une structure tertiaire particulière appelée G-quadruplex retrouvée au niveau des séquences télomériques. Notre hypothèse de travail stipule que la surexpression de TRF2 favoriserait l épissage conduisant aux formes pro-angiogéniques et entraînerait une croissance anormale et une angiogenèse excessive. Des résultats préliminaires montrent que TRF2 se lie à ces 44 bases, liaison diminuée par des mutations empêchant la formation du G-quadruplex. Des résultats préliminaires semblent indiquer que l expression de TRF2 SXXXA a un effet positif sur la sécrétion de VEGF165b. Nous approfondirons ces résultats en analysant la capacité de TRF2 SXXXA à se lier aux 44 paires de bases in vitro et in vivo et en étudiant l effet de l expression des formes sauvage et mutée de TRF2 sur la sécrétion des deux isoformes du VEGF in vivo. Nous disposons de cellules exprimant ces protéines ainsi que de kits ELISA commerciaux permettant de doser indépendamment les deux isoformes du VEGF. 4

6 i) Confirmation de l interaction TRF2/44 bases par des expériences de liaison avec des extraits de cellules normales ou tumorales traitées ou non par un inhibiteur d ERK. ii) Expériences d immunoprécipitation d ARN avec des anticorps anti-trf2/interaction in vivo. iii) Génération d un vecteur rapporteur d épissage 21 permettant de déterminer le rôle fonctionnel de TRF2 wt ou mutant SXXXA ou +/- inhibiteurs ERK. iv) Down-régulation de TRF2 par sh-rna et rôle sur la production de VEGF165b. Conclusions Cette partie du projet consiste à mettre en évidence un rôle «non télomérique» de TRF2 et sa participation aux phénomènes d angiogenèse participant au développement tumoral. BIBLIOGRAPHIE 1. Kim, N.W. et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 266, (1994). 2. van Steensel, B., Smogorzewska, A. & de Lange, T. TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions. Cell 92, (1998). 3. Takai, H., Smogorzewska, A. & de Lange, T. DNA damage foci at dysfunctional telomeres. Curr. Biol 13, (2003). 4. Diehl, M.C. et al. Elevated TRF2 in advanced breast cancers with short telomeres. Breast Cancer Res. Treat 127, (2011). 5. Dong, W., Wang, L., Chen, X., Sun, P. & Wu, Y. Upregulation and CpG island hypomethylation of the TRF2 gene in human gastric cancer. Dig. Dis. Sci 55, (2010). 6. Lantuejoul, S. et al. Telomere maintenance and DNA damage responses during lung carcinogenesis. Clin. Cancer Res 16, (2010). 7. Oh, B.-K., Kim, Y.-J., Park, C. & Park, Y.N. Up-regulation of telomere-binding proteins, TRF1, TRF2, and TIN2 is related to telomere shortening during human multistep hepatocarcinogenesis. Am. J. Pathol 166, (2005). 8. Yang, S.H., Yates, P.R., Whitmarsh, A.J., Davis, R.J. & Sharrocks, A.D. The Elk-1 ETS-domain transcription factor contains a mitogen-activated protein kinase targeting motif. Mol. Cell. Biol 18, (1998). 9. Herbig, U., Jobling, W.A., Chen, B.P.C., Chen, D.J. & Sedivy, J.M. Telomere shortening triggers senescence of human cells through a pathway involving ATM, p53, and p21(cip1), but not p16(ink4a). Mol. Cell 14, (2004). 10. Fujita, K. et al. Positive feedback between p53 and TRF2 during telomere-damage signalling and cellular senescence. Nat. Cell Biol 12, (2010). 11. Matsuo, K. et al. SIAH1 inactivation correlates with tumor progression in hepatocellular carcinomas. Genes Chromosomes Cancer 36, (2003). 12. Horikawa, I., Fujita, K. & Harris, C.C. p53 governs telomere regulation feedback too, via TRF2. Aging (Albany NY) 3, (2011). 13. Okazaki, K. & Sagata, N. The Mos/MAP kinase pathway stabilizes c-fos by phosphorylation and augments its transforming activity in NIH 3T3 cells. EMBO J 14, (1995). 14. Tanoue, T., Adachi, M., Moriguchi, T. & Nishida, E. A conserved docking motif in MAP kinases common to substrates, activators and regulators. Nat Cell Biol 2, (2000). 15. Bardwell, A.J., Flatauer, L.J., Matsukuma, K., Thorner, J. & Bardwell, L. A conserved docking site in MEKs mediates high-affinity binding to MAP kinases and cooperates with a scaffold protein to enhance signal transmission. J. Biol. Chem 276, (2001). 16. Onesto, C. et al. Vascular endothelial growth factor-a and Poly(A) binding protein-interacting protein 2 expression in human head and neck carcinomas: correlation and prognostic significance. Br. J. Cancer 94, (2006). 17. Hoshino, R. et al. Constitutive activation of the 41-/43-kDa mitogen-activated protein kinase signaling pathway in human tumors. Oncogene 18, (1999). 18. Bradshaw, P.S., Stavropoulos, D.J. & Meyn, M.S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat Genet 37, (2005). 19. Zhang, P. et al. Nontelomeric TRF2-REST interaction modulates neuronal gene silencing and fate of tumor and stem cells. Curr. Biol 18, (2008). 20. Bates, D.O. et al. VEGF165b, an inhibitory splice variant of vascular endothelial growth factor, is down-regulated in renal cell carcinoma. Cancer Res 62, (2002). 21. Matter, N., Herrlich, P. & König, H. Signal-dependent regulation of splicing via phosphorylation of Sam68. Nature 420, (2002). 5