Des réseaux d'interactions à la modélisation : intérêt pour l'étude du mécanisme d'action de l'endostatine Prof. Sylvie Ricard Blum
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1 Des réseaux d'interactions à la modélisation : intérêt pour l'étude du mécanisme d'action de l'endostatine Prof. Sylvie Ricard Blum Institut de Biologie et Chimie des Protéines UMR 5086 BMSSI CNRS Université Lyon 1
2 L endostatine, une protéine d intérêt thérapeutique Fragment (21 kda) d une protéine extracellulaire, le collagène XVIII Présente dans les membranes basales vasculaires Activité anti angiogénique et anti tumorale Approuvée pour le traitement de cancer du poumon depuis 2005 en Chine
3 L endostatine, une protéine d intérêt thérapeutique Cibles : les cellules endothéliales Plusieurs récepteurs (intégrines, VEGFR2) et corécepteurs (glypicans 1 et 4, héparanes sulfate) Interactions avec d autres protéines régulant l angiogenèse (endorépelline) Nécessité d une approche globale intégrant tous les partenaires de l endostatine à la surface cellulaire et au sein de la matrice extracellulaire pour déterminer son mécanisme d action
4 Recensement des partenaires de l endostatine Recherche dans la littérature Recherche dans des bases de données d interactions (IntAct, MINT, DIP, HPRD) Très peu d interactions extracellulaires dans les bases de données Création d une base de données des interactions spécifiques de la matrice extracellulaire MatrixDB, the extracellular interaction database
5 Chautard et al. Bioinformatics : Chautard et al. Nucleic Acids Res (Database issue):d235 40
6 Spécificités de MatrixDB Interactions Protéine protéine Protéine glycosaminoglycane Protéine cation Protéine lipide Multimères Collagènes Laminines Thrombospondines Intégrines Fragments bioactifs (matricryptines) Endostatine Endorépelline Tumstatine
7 Chautard et al. Nucleic Acids Res :D235 40
8 The basement membrane interaction network Annexine 2 Collagène 1(IV) Nidogène 2 (Chautard E, Ballut L, Thierry Mieg N, Ricard Blum S. Bioinformatics :690 1)
9 The IMEx consortium is a group of public interaction data providers sharing curation effort and exchanging completed records on molecular interaction data
10 Développement de puces pour identifier des partenaires Dépôt de protéines et de polysaccharides sur des puces recouvertes d or Injection de l endostatine sur les puces (15 20 min, 500 μl/min) Fixation non spécifique évaluée sur des spots de référence sciflexarrayer S3 (Scienion) Détection des interactions par imagerie SPR (Surface Plasmon Resonance, Biacore Flexchip, GE Healthcare) Jusqu à 400 interactions suivies simultanément Criblage d interactants potentiels d une protéine
11 Protéines déposées sur les puces Protéines et domaines protéiques Collagènes I, II, III, IV, V, VI Endostatine, fragment du collagène XVIII Laminine 111 Fibronectine Extracellular matrix 1 protein Protéines matricellulaires : ostéopontine, SPARC, thrombospondine 1 Vitronectine Plasminogène Protéines recombinantes exprimées au laboratoire ou disponibles commercialement
12 Protéoglycanes et glycosaminoglycanes déposés sur les puces Protéoglycanes Agrécan, biglycan, perlecan Protéine porteuse des protéoglycanes Brévican Glypicans 1 3, 5 6 Neurocan Neuroglycan Syndécans 1 4 Glycosaminoglycanes et oligosaccharides Chondroïtine sulfate, dermatane sulfate Héparane sulfate, héparine, hyaluronan Facteurs de croissance et leurs récepteurs FGF 2, VEGF, VEGFR 2
13 Identification de nouveaux partenaires de l endostatine Imagerie SPR Transglutaminase 2 (Faye et al. J. Biol. Chem : , Faye et al. Biochem J :467 75)
14 Le réseau d interactions de l endostatine (Faye et al. J. Biol. Chem : )
15 L interactome de l endostatine : un outil pour explorer ses fonctions biologiques Nouveaux partenaires de l endostatine, nouvelles fonctions? Domaines protéiques du réseau : des pistes pour la recherche de nouveaux partenaires Modélisation du réseau de l endostatine à la surface cellulaire Cellules endothéliales
16 Sur représentation des domaines EGF* dans les partenaires de l endostatine Recherche de nouveaux partenaires de l endostatine parmi les protéines contenant un domaine EGF (*EGF: Epidermal Growth Factor)
17 D un réseau statique à un réseau dynamique Données d expression Intégration dans le réseau de Sites d interaction (mutations et modélisation) Cinétique et affinité des interactions (SPR)
18 Intégration des sites d interaction Détermination des sites d interaction Mutagenèse (in vitro) Modélisation moléculaire (in silico). Arg 27 Arg 139 Héparane sulfate Intégrines ( v 3, 5 1) Transglutaminase 2 Nucléoline L endostatine ne peut pas interagir simultanément avec tous ses partenaires à la surface cellulaire
19 Prédiction des sites d interaction : modélisation moléculaire Fixation de l héparine sur la face positive de l endostatine (Ricard Blum et al. J Biol Chem : ) Fixation de l endostatine sur la tête de l intégrine v 3 Modèle sélectionné d après les expériences de mutagenèse et d inhibition SPR (Faye et al. J Biol Chem 2009a 284: )
20 Intégration de l affinité dans le réseau d interactions de l endostatine Intégration de l affinité et de la cinétique calculées par SPR pour hiérarchiser les interactions au sein du réseau K D force de l interaction ka reconnaissance moléculaire kd stabilité des complexes Choix des valeurs à intégrer
21 Cinétique et affinité des interactions (SPR*) Un interactant est immobilisé sur un support solide (sensor chip) Le 2 ème interactant est injecté dans un flux de tampon sur la molécule immobilisée Détection des interactions par SPR Pas de marquage des interactants Suivi des interactions en temps réel Calcul des constantes cinétiques et de l affinité Suivi de 3 interactions (Biacore T100) *Résonance plasmonique de surface
22 Modélisation du réseau de l endostatine à la surface cellulaire K D calculés par SPR Inhibition par l endostatine Elaboration d un modèle dynamique appliqué à un ensemble d espèces chimiques réagissant deux à deux N. Théret, M. Le Borgne, G. Andrieux Basé sur la Chemical Reaction Network Theory (Feinberg, 1987)
23 Conclusion et perspectives Construction du réseau d interactions de l endostatine Création d une base de données d interactions Développement de puces Analyse structurale et fonctionnelle du réseau nouvelles fonctions de l endostatine à explorer Modélisation du réseau de l endostatine à la surface cellulaire Mécanisme d action Prédiction du comportement du réseau
24 E. Chautard M. Fatoux Ardore C. Faye R. Salza L. Blum, C. Marquette, UMR 5246 CNRS Université Lyon 1 N. Thierry Mieg, TIMC UMR 5525 CNRS, Grenoble N. Théret, M. Le Borgne, G. Andrieux PSIMEx grant FP7 HEALTH
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