Les autres formes de mort cellulaire - implications en oncogénèse -

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1 UE «Biologie de la transformation épithéliale respiratoire» «cellules épithéliales respiratoires et cancer» Paris - 21 Novembre 2012 Les voies classiques Les autres formes de mort cellulaire - implications en oncogénèse - Texte «Programmée» exemple: Apoptose «Accidentelle» exemple: Nécrose Vandenabeele et al., 2010 Lamkanfi et al., 2010 Vandenabeele et al., 2010 Lamkanfi et al., il n y a pas que l apoptose dans la mort - Arnaud Mailleux INSERM U700 Faculté de Médecine Paris Diderot, site X. Bichat - Pyknosis (condensation chromatine) - Karrorhexis (fragmentation nucléaire) - Maintien intégrité membrane - Renflement / protusion membrane - Formation corps apoptotiques - Activation des caspases - Oncosis - Condensation modérée chromatine - Karyolysis (lyse chromatine) - Stress oxidatif - Rupture des membranes «Nomenclature Committee on Cell Death 2009» - processus de mort cellulaire atypiques - voies de mort cellulaire programmées? Autophagie CICD Necroptosis Anoikis Kératinisation 3 Emperipolesis entosis, cannibalisme

2 Vraiment alternatives? voies de mort cellulaire programmées? - Autophagie - CICD - Necroptose - Anoikis mécanismes programmés de mort cellulaire distincts ou Autophagie Necroptosis Anoikis CICD Kératinisation - Kératinisation - Emperipolesis / entosis processus menant à l apoptose ou à la nécrose cellulaire? Emperipolesis entosis, cannibalisme «Macroautophagie» alias Autophagie - Pubmed: 3082 articles sur «autophagy AND cancer» Autophagie: vie et mort de l autophagosome - Processus hautement dynamique - - Mécanisme contrôlant la dégradation de cytoplasme, de protéines et d organites protéines «mal repliées» organites superflus ou endommagés - Source de nutriments en cas de privation ou de stress divers 7 Mizushima et al., 2010 Processus caractérisé par des vacuoles à double membrane phospholipidique Yang et al.,

3 Origine multiple des autophagosomes Régulation de l autophagie - voies cellulaires de l'homéostase énergétique - Régulation de TOR: ATP / energie Facteurs de croissance - Régulation de Beclin: Stress Apoptose Cuervo et al., Autophagie et cancer - Formation d'agrégats de protéine LC3 (marqueur autophagosome) Yang et al., 2010 Yang et al., favorise la survie cellulaire Klionsky et al., 2008

4 - Augmentation nombre autophagosome par MET - Approche «statique» GFP-LC3 et MET. Klionsky et al., 2008 Mizushima et al., 2010 «cas idéal» Mizushima et al., Accumulation autophagosomes: - augmentation production autophagosome - inhibition dégradation par lysosome Klionsky et al., Western blot pour LC3-II pour étude «dynamique» de l autophagie LC3-I (forme cytoplasmique) LC3-II (forme membranaire avec résidu PE) Klionsky et al., 2008, 2012

5 - Western blot pour LC3-II pour étude «dynamique» de l autophagie Inhibition du flux autophagique: western blot LC3 en présence d inhibiteur lysosome (Chloroquine ou Bafilomycine 1A) LC3-I (forme cytoplasmique) LC3-II (forme membranaire avec résidu PE) Texte Basale + CQ ou BAF-1A Klionsky et al., 2008 L autophagie est un flux. Inhibition du flux autophagique: western blot LC3 en présence d inhibiteur lysosome (Chloroquine ou Bafilomycine 1A) Texte Basale + CQ ou BAF-1A Klionsky et al., Western blot pour LC3-II et SQSTM1 (P62) SQSTM1 (interaction avec résidu Ub): cargo dégradée avec protéine ubiquitinylée dans autophagosome. Texte inhibition formation autophagosome inhibition dégradation autophagosome

6 - Western blot pour LC3-II et SQSTM1 (P62) SQSTM1 (interaction avec résidu Ub): cargo dégradée avec protéine ubiquitinylée dans autophagosome. Texte Autophagie: survie ou mort? - Survie dans la majorité des cas. - Mort cellulaire dans cas particuliers: - Développement embryonnaire (Drosophile). - Cancer (machinerie apoptotique ou caspase défectueuse). Galluzi et al., 2012 inhibition formation autophagosome inhibition dégradation autophagosome critère: inhibition pharmacologique ou génétique de la 22 machinerie autophagique supprime la mort cellulaire observée voies de mort cellulaire programmées? CICD «Caspase independent cell death» Autophagie CICD - Mise en évidence quand des composants de la voie intrinsèque sont défectueux (Apaf-1, cytochrome-c, Caspase-9, surexpression XIAP). Necroptosis Anoikis Kératinisation - Souris Apaf-1 -/- : CICD permet formation de l espace interdigital Emperipolesis entosis, cannibalisme Perméablisation membrane externe mitochondrie («MOMP») est requise: CICD inhibée dans cellules Apaf-1 -/- surexprimant BCL-2

7 La mitochondrie joue un rôle central dans la CICD CICD «Caspase independent cell death» La mort cellulaire en absence d activation des Caspases - terme générique et définition par défaut Galluzi et al., 2012 Difficile à détecter in vivo en l absence de marqueurs spécifiques Cinétique: Lente Noyau Condensation partielle de la chromatine Pas de formation échelle ADN Pas de fragmentation du noyau Mitochondrie Perméabilisation membrane externe (MOMP) Perte potentiel lente Génération ROS Cytoplasme Présence d autophagosome / vacuole Aggrégation des ribosomes Absence de clivage des cibles des caspases Membrane: Négative pour Annexine V voies de mort cellulaire programmées? Autophagie CICD - Apoptose (Kerr et al., Br. J. Cancer 1972) Définition: Programme de mort cellulaire contrôlé par les Caspases (cysteine aspartic acid-specific proteases)! Changements morphologiques et biochimiques caractéristiques Necroptosis Anoikis Kératinisation Emperipolesis entosis, cannibalisme Pyroptosis

8 Nécrose cellulaire - Necroptosis (Degterev et al., Nat Chem Biol 2005 ) Définition: - Forme programmée de nécrose cellulaire - Oncosis - Condensation modérée chromatine - Karyolysis (lyse chromatine) - Stress oxidatif - Rupture des membranes Vandenabeele et al., 2010 Lamkanfi et al., L929: lignée fibrosarcome murine - Mort cellulaire induite par TNF / FAS en présence de z-vad-fmk - Inhibiteur spécifique: necrostatin-1 (NEC-1) Degterev et al., dépend du contexte et du type cellulaire. Necroptosis: forme programmée de nécrose Réponses différentes au TNF!: croissance - dépend du contexte et du type cellulaire - Necroptosis: forme programmée de nécrose Réponses différentes au TNF!: - dépend du contexte et du type cellulaire - croissance apoptose Challa S. et al., 2010 Vandenabeele et al., 2010 Vandenabeele et al., 2010 complexe membranaire complexe membranaire complexes cytosoliques Rôle central des kinases RIP1 et RIP3 Tait et al., 2008 Rôle central des kinases RIP1 et RIP3 Tait et al., 2008

9 Necroptosis: forme programmée de nécrose Réponses différentes au TNF!: - dépend du contexte et du type cellulaire - croissance apoptose necroptosis Détermination des gènes nécessaires dans un crible par ARNi (smartpool) (4 sirna / gene) Vandenabeele et al., 2010 complexe membranaire (RIP1 polyubiquitinylée) complexes cytosoliques DISC (RIP1 déubiquitinylée et recrutement FADD) Mort «programmée» car la modulation de RIP1 et RIP3 perturbe la necroptosis NEC-1: inhibiteur RIP1 Tait et al., 2008 (en aval de RIP1) (apoptose) Liste complète: Hitomi et al., Cell Necroptosis: rôle prédominant des ROS Caractéristiques de CICD Necroptosis: implication in vivo - Implication in vivo: développement et maladie dégénérative - Nécroptose des cellules de Paneth chez les patients atteints de la maladie de Crohn Günther et al., Nature Modèle animaux: exemples de RIP1 et RIP3 inhibiteur de RIP1 (NEC-1) -! métabolisme: * génération ROS * péroxidation lipides: rupture des lysosomes - Inhibition ANT (pore mitochondrie): " ATP cytoplasmique - Perméabilisation mitochondrie modèles génétiques: Vandenabeele et al., 2010 Galluzi et al., 2012 Vandenabeele et al., 2010

10 Necroptosis Nécrose cellulaire sous le contrôle du complexe RIP1 et RIP3 TNF complexe membranaire complexe cytoplasmique OUI activation caspase 8 OUI apoptose NON NON Elimination cellule Croissance activation RIP1 / RIP3 necroptose - Pubmed: 192 articles sur «necroptosis» et 55 articles sur «necroptosis AND cancer» depuis 2005 (contexte d apoptose défficiente). Necroptosis Nécrose cellulaire sous le contrôle du complexe RIP1 et RIP3 - plusieurs caractéristiques communes avec CICD - L activation des kinases RIP permet de distinguer de la nécrose Cinétique: Lente Noyau Condensation partielle de la chromatine Pas de fragmentation du noyau Mitochondrie Perméabilisation membrane externe (MOMP) Perte potentiel lente Génération ROS Cytoplasme Absence de clivage des cibles des caspases Rupture membrane lysosome Présence d autophagosome Activation des kinases RIP1 et RIP3 Difficile à détecter in vivo en l absence de marqueurs spécifiques voies de mort cellulaire programmées? Exemples de mécanismes alternatifs de mort cellulaire mis en jeu lorsque l apoptose est défectueuse Autophagie CICD - Morphogenèse mammaire in vitro Necroptosis Anoikis Kératinisation Emperipolesis entosis, cannibalisme Pyroptosis Acinus de cellule MCF-10A

11 Modèle in vitro de morphogenèse mammaire: culture cellulaire d acini Morphogenèse in vitro d acinus épithélial «clonal» établissement polarité formation du lumen MCF-10A Jour 4 Jour 8 Jours 8-12 Jour 14 Lignée MCF-10A: cellules immortalisées mais non transformées. - amplification MYC - inactivation locus p16/arf Culture matrigel Golgi Marqueur de polarité apico-basal Caspase 3* Marqueur d apoptose Brugge J. Morphogenèse in vitro d acinus épithélial «clonal» BIM: facteur pro-apoptotique «BH3-only» BH3-only family Bid Cory et al., 2002 Bim, Bik, Bad, Bmf, Hrk, Noxa, Puma Cory et al., 2002 Cleaved caspase 3 Apoptose Debnath J. et al., 2002 Reginato M. et al., 2005 Schmelzle T. et al., 2007 Mailleux A. et al., 2008 Protéines pro-apoptotique BH3: inactivateur des protéines anti-apoptotiques ou activateurs de BAX / BAK

12 BIM, BMF: facteurs pro-apoptotiques «BH3-only» Rôle de l apoptose dans la formation de la lumière des acini de cellules MCF-10A L inhibition de l apoptose n est pas suffisante pour permettre l'invasion du lumen Debnath J. et al., 2002 Reginato M. et al., 2005 Schmelzle T. et al., 2007 Mailleux A. et al., 2008 Les cellules centrales sont dépourvues de contact avec la matrice extracellulaire ROS - ANOIKIS (Frisch et al. JCB 1994) Définition: - Mort cellulaire déclenchée suite à la perte de contact d une cellule épithéliale avec la matrice extracellulaire! perte de l engagement des intégrines! forme d apoptose les fibroblastes normaux ne sont pas sensibles Laminin V Cleaved caspase 3 Apoptose DCF-DA Stress oxydant Debnath J. et al., 2002 Reginato M. et al., 2005 Schmelzle T. et al., 2007 Mailleux A. et al., 2008 Schaefer et al., 2009 les cellules épithéliales sont protégées dans certaines conditions: - Surexpression de BCL-2 - Expression d oncogène Vicente-Manzanares et al., 2008

13 - ANOIKIS! protège contre la prolifération ectopique de cellules (altération de l architecture tissulaire) Contexte physiologique: formation de la lumière de structure épithéliale au cours de la morphogénèse Contexte oncogénique: bloque l invasion et formation des métastases Anoikis de cellules mammaires MCF-10A Anoikis MCF-10A - Perte engagement des Intégrines. - Inhibition expression EGFR!Induction BIM et BMF -Inhibition de l absorption du glucose!induction ROS Formation du lumen en 3D - perte de contact avec la matrice extracellulaire et ROS MCF-10A (24h)!Intégration par BIM / BMF pour induire apoptose Reginato et al, 2003, Schmelzle T. et al., 2007 et Mailleux A. et al., 2008 L inhibition de l apoptose est compensée par un phénomène de ROS. Coopération entre oncogènes et mort cellulaire altérée - arrêt de croissance - lumière - augmentation prolifération - lumière Exemple de CICD - hyperprolifération - lumière Processus de mort non-programmée? DCF-DA Stress oxydant Debnath J. et al., 2002 Reginato M. et al., 2005 Schmelzle T. et al., 2007 Mailleux A. et al., 2008!"#$%&'()*("&(%+*,( hyperprolifération - pas de lumière

14 Coopération entre oncogènes et mort cellulaire altérée Coopération entre oncogènes et mort cellulaire altérée./0.12/ :6;<94!"#"$#%&%'(&%' (&'.#-$')&**+*!0-&!"#$%&'"(,-.(/(0*01!"#$%&'()*("&(%+*,(-../!"#$%&'()*("&(%+*,(-..-!"#$%&'()*+(,-!"#$%&'()*("&(%+*,(-..- 0"12$%&3(4*("&(%+*,(-../ Coopération entre oncogènes et mort cellulaire altérée Cellules mammaires en suspension!"#$%&'()*+(,-./0.12/ :6;<94!"#"$#%&%'(&%' )&**+*&%')&,$-!*&%!"#$%&'()*("&(%+*,(-..- 0"12$%&3(4*("&(%+*,(-../ (:;(/()0<3= 8/C;48./(DA (&'.#-$')&**+*!0-& HPV E7: pas dʼinvasion lumière " induction BIM ROS ErbB2: invasion lumière " diminution BIM et ROS vsrc: luminal filling diminution BIM et ROS - Apoptose - Autophagie anoikis (Reginato et al., Nat Cell Bio. 2003) (Fung et al, MBC 2008) - Stress métabolique / ROS (Schafer et al, Nature 2009)

15 voies de mort cellulaire programmées? Kératinisation des cellules mammaires en suspension Autophagie CICD Anoikis MCF-10A Necroptosis Anoikis Kératinisation Epidermis Development Emperipolesis entosis, cannibalisme Pyroptosis Keratinization att susp Kératinisation Définition: Différenciation des couches profondes de l épiderme en couche cornée - accumulation et formation d un réseau très dense de kératines - perte du noyau et des organelles - mort de la cellule en fin de processus Marqueurs de différenciation squameuse FLG LOR K10 K1 K6, K5, K14, p63 Dupont JM, Perle de kératine au sein d une tumeur mammaire chez la souris

16 Expression de K10 et FLG en suspension Kératinisation d acini de cellules hmecs - «Human primary Mammary Epithelial Cells» immortalisées avec htert - suspension suspension d18 hmec htert Kératinisation d acini de cellules hmecs Méthodes pour identification kératinisation Morphologie caractéristique en histologie. Expression de marqueurs spécifiques : basale: K5, K6, K14 et P63 granulaire: K1, K10 cornée: FLG, LOR "1-INT "-CAT - IHC, IF - western blot Les cellules centrales sont Intégrine-"1 neg et subissent une différenciation squameuse complète.

17 Exemples de mécanismes alternatifs de mort cellulaire mis en jeu lorsque l apoptose est défectueuse - Morphogenèse mammaire in vitro et in vivo Cellules mammaires en suspension anoikis Acinus de cellule MCF-10A Bourgeon terminal mammaire de souris CICD et kératinisation dans les canaux mammaires des souris Bim-/- - Apoptose - Autophagie - Stress métabolique - Kératinisation (Reginato et al., Nat Cell Bio. 2003) (Fung et al, MBC 2008) (Schafer et al, Nature 2009) (Mailleux et al., Dev Cell 2007) voies de mort cellulaire programmées? Autophagie CICD Structure «Cell in cell» en suspension MCF-10A Necroptosis Anoikis Kératinisation Emperipolesis entosis, cannibalisme! Observation similaire avec lignée MCF-7 (Overholtzer et al. 2007)

18 Structure «Cell in cell» en culture - Emperipolesis (Humble et al., Br. J. Haematol, 1956) Définition: Invasion d une cellule vivante par une autre.! homotypique ou hétérotypique.! Forme d Emperipolesis (Overholtzer et al. 2008)! «Cannibalisme cellulaire» Emperopelesis homotypique de cellules mammaires Processus indépendant de l apoptose - Internalisation importante dès 6h. - Apoptose détectable à 48h.

19 La cellule internalisée est vivante Le cytosquelette d actine est nécessaire. LatB: actine pol. Blebb: Myosin II TatC3: Rho Y27632: Rock H1152: Rock! Pas un processus de phagocytose de cellules mortes Ridley et al., 1999 Le cytosquelette d actine est nécessaire. La cellule internalisée envahit activement l hôte LatB: actine pol. Blebb: Myosin II TatC3: Rho Y27632: Rock H1152: Rock Y27632 (Y27632 inhibiteur)

20 Jonctions adhérentes sont nécessaires Jonctions adhérentes sont nécessaires EDTA Jonctions adhérentes: Jonctions adhérentes: - Interactions via les Cadhérines (Ca 2+ indispensable). - Interactions via les cadhérines (Ca 2+ indispensable). - Reliées au cytosquelette d actine via les caténines (résultat similaire avec MCF-7) - Reliées au cytosquelette d actine via les caténines (résultat similaire avec MCF-7) Un processus de compaction en l absence d engagment des intégrines - Entosis () Définition: - Forme d emperipolesis où une cellule vivante envahit une cellule hôte à l aide de forces contractiles associées aux jonctions adhérentes! Devenir de la cellule internalisée?

21 Mort non-apoptotique de la cellule internalisée La cellule internalisée subit une dégradation lysosomale dans la cellule hôte. - Substrat pour la Cathepsine B une protéase lysosomale - LAMP-1: protéine de la membrane des lysosomes - Lysostracker Red marque les compartiments cellulaires acides Les destins de la cellule internalisée 1) Mort cellulaire Les autres destins de la cellule internalisée 2) libération

22 Les autres destins de la cellule internalisée Entosis 3) Division cellulaire Overholtzer et al., 2008 Entosis d autres lignées cellulaires en suspension Présence de figures d entosis in vivo (mammaire)! cellules cancéreuse provenant d effusion pleurale (ovaire) (mesotheliale) (endothéliale) (rénale embryonnaire) (mammaire) Facile à mettre en évidence in vitro

23 Présence de figures d entosis dans des tumeurs humaines in vivo! Difficile à mettre en évidence in vivo Destin de la cellule hôte l entose mène à l aneuploïdie tumorale (de manière non génétique) Les figures d entose sont multinucléées (30-45% in tumors) Krajcovic et al., Nat Cell Bio 2011 Destin de la cellule hôte L entose peturbe la cytocinèse et induit la formation de cellules filles aneuploïdes. Destin de la cellule hôte L entose peturbe la cytocinèse et induit la formation de cellules filles aneuploïdes. Succès de la cytocinèse Krajcovic et al., Nat Cell Bio 2011 Echec de la cytocinèse Krajcovic et al., Nat Cell Bio 2011

24 Destin de la cellule hôte La cellule internalisée perturbe la formation du sillon de division entre les deux cellules filles Succès cytocinèse Echec cytocinèse Mailleux, 2011 Méthodes pour identification entosis pas de marqueurs spécifiques pour entosis - In vitro: observation directe des cellules - Morphologie et dynamique caractéristiques (VDM) - Jonctions adhérentes pour interaction homotypique: IF / IHC pour "-CAT, CADH Méthodes pour identification entosis pas de marqueurs spécifiques pour entosis - In vivo: observation directe en histologie par IF ou IHC Corrélation entre: - Cellule épithéliale internalisée IF "-CAT, MUC-1, Cytokératines - Marqueurs de lysosomes: Substrat pour la Cathepsine B une protéase lysosomale LAMP-1: protéine de la membrane des lysosomes Lysostracker Red marque les compartiments cellulaires acides - Marqueurs mort cellulaire: TUNEL / Caspase 3* IF - Présence lysosome IF LAMP-1 - CICD TUNEL pos / Caspase 3* neg carcinomes mammaires - confocal

25 Cellules mammaires en suspension Cellules épithéliales en suspension suspension suspension - Apoptose (Reginato et al., Nat Cell Bio. 2003) perte engagement intégrine autophagie - Autophagie - Stress métabolique - Kératinisation -Entosis () (Fung et al, MBC 2008) (Mailleux et al., Dev Cell 2007) (Schafer et al, Nature 2009) anoikis «rapide» OUI Elimination cellule NON stress métabolique anoikis «cinétique lente» kératinisation entosis mort cellule OUI Elimination cellule NON survie en suspension voies de mort cellulaire programmées? Mort cellulaire programmée «alternative»? Autophagie CICD - Autophagie OUI Necroptosis Anoikis Kératinisation - CICD - Necroptosis ni OUI ni NON OUI - Anoikis NON Emperipolesis entosis, cannibalisme - Kératinisation - Emperipolesis / entosis OUI?

26 - Autophagie - CICD - Necroptosis Implication de ces processus dans le cancer OUI OUI OUI Bibliographie sélective Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012 Galluzzi et al., Cell Death Differ (19): (suite des recommandations publiées en 2005 et 2009) Eaten alive: a history of macroautophagy Yang Z. and Klionsky DJ. Nat Cell Biol Sep;12(9): Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy Klionsky DJ et al. Autophagy 8:4, ; April Anoikis - Kératinisation - Emperipolesis / entosis OUI OUI OUI Caspase-independent cell death: leaving the set without the final cut. Tait SW, Green DR. Oncogene Oct 27;27(50): Molecular mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion. Vandenabeele P et al., Nat Rev Mol Cell Biol Oct;11(10): The cell biology of cell-in-cell structures. Overholtzer M, Brugge JS. Nat Rev Mol Cell Biol Oct;9(10):