BIOLOGIE DE L ALLERGIE
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- Martial Beaudoin
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1 BIOLOGIE DE L ALLERGIE 9h -10h15: L'exploration de l'hypersensibilité de type I: des extraits allergéniques aux allergènes moléculaires- F.Bienvenu 10h15-10h45: Présentation d'un dossier clinique. O. Marchand 10h45-11h00: Discussion Pause 11h00-11h30: Le test d'activation des basophiles: intérêt et limites J.Bienvenu 11h30-12h00: L'exploration de l'hypersensibilité de type IV: application à l'immunité antituberculeuse- L.Garnier 1
2 INTERET DU TEST D ACTIVATION DES BASOPHILES DANS L EXPLORATION DE L ALLERGIE MEDICAMENTEUSE --- Biologie de l allergie Lyon - 20 Février 2014 J. Bienvenu, S. Viel, P. Rouzaire, L. Garnier, et F. Bienvenu Laboratoire d Immunologie CHU Lyon-Sud 2
3 LES REACTIONS D HYPERSENSIBILITE AUX MEDICAMENTS Introduction Réactions d hypersensibilité aux médicaments Hypersensibilité Allergique (HSA) Hypersensibilité Non-Allergique (HSNA) 3
4 LES REACTIONS D HYPERSENSIBILITE AUX MEDICAMENTS Introduction Réactions d hypersensibilité aux médicaments Hypersensibilité Allergique (HSA) Hypersensibilité Non-Allergique (HSNA) Hypersensibilité Immédiate (HSI) < 1 heure IgE médiée Hypersensibilité Retardée (HSR) 24 à 72 heures lymphocytes T 4
5 Biologie de l hypersensibilité aux médicaments Biologie de l hypersensibilité immédiate Dosages de médiateurs solubles au moment de l accident Dosages d IgE spécifiques Techniques d activation ex vivo de basophiles Biologie de l hypersensibilité retardée Tests de transformation lymphocytaire Tests d activation lymphocytaire en cytométrie Tests de détection de cytokines ( ELISPOT) 5
6 Biologie de l hypersensibilité immédiate Dosages de médiateurs solubles au moment de l accident Dosages d IgE spécifiques Techniques d activation ex vivo de basophiles Biologie de l hypersensibilité retardée Tests de transformation lymphocytaire Tests d activation lymphocytaire en cytométrie Tests de détection de cytokines ( ELISPOT) 6
7 Physiopathologie de l hypersensibilité de type I : Phase de sensibilisation Phase de déclenchement IL-4,IL-5 CD4 Cellule Th2 Cellule B + allergène Basophile ou mastocyte sensibilisé DEGRANULATION Plasmocyte IgE But : activer in vitro des basophiles porteurs d IgE spécifiques de l allergène 7
8 Principe Pourquoi étudier le basophile? Marqueurs d identification du basophile Marqueurs d activation du basophile Activation des mastocytes et des basophiles à l origine des réactions d hypersensibilité immédiate Accessibilité : Les basophiles sont présents dans le sang circulant contrairement aux mastocytes dont ils présentent la majorité des propriétés, en particulier pour détecter une sensibilisation Les basophiles présentent à leur surface des récepteurs de forte affinité pour les IgE (FcεRI). Après «pontage» de ces récepteurs par l allergène, les médiateurs libérés déclenchent les phénomènes allergiques 8
9 La signalisation Principe Marqueurs d identification du basophile Marqueurs d activation du basophile 9 Wu LC, J Biol Chem, 2011
10 Principe Concrètement pour nous Marqueurs d identification du basophile Marqueurs d activation du basophile 2. Pontage des récepteurs RcεRI par l allergène (via les IgE spécifiques de celui-ci) 1. Incubation des basophiles sensibilisés avec l allergène ayant provoqué la réaction 3. Libération des médiateurs et modifications du phénotype du basophile Expression constitutive faible de CD203c à la surface Surexpression de CD203c à la surface Expression de CD63 à la surface Relargage de médiateurs solubles Dosage des médiateurs libérés Mesure des modifications phénotypiques en cytométrie 10
11 Cytométrie en Flux / Principes Suspension cellulaire Liquide de gaine Filtres dichroïques PMT 2 Filtres PMT 1 Granulosité (SSC) Laser Photodiode Taille (FSC) 11
12 Anti-IgE : Première stratégie décrite Peu spécifique (monocytes, éosinophiles, cellules dendritiques) Variation inter- et intra-individuelle de la densité des récepteurs des IgE CD203c et anti-ige : CD203c présent uniquement sur les basophiles au niveau du sang CD123 et HLA-DR : CD123+ : IL3-R Principe Principales stratégies utilisées : HLA-DR- : exclusion des monocytes CCR3 et faible SSC : CCR3 présent sur les basophiles, éosinophiles, détectable sur les lymphocytes Th1 et Th2 CRTH2 et CD3 : CRTH2+ : récepteur de la prostaglandine D2 exprimé par les Th2, éosinophiles et basophiles CD3- : exclusion des lymphocytes Th2 Marqueurs d identification du basophile Marqueurs d activation du basophile 12
13 Principe Marqueurs d identification du basophile Marqueurs d activation du basophile CCR3 - faible SSC : CRTH2 - faible SSC - CD3 : Eosinophiles A CRTH2 Lymphocytes Th2 Basophiles 13
14 Principe Marqueurs d identification du basophile Marqueurs d activation du basophile CD203c et CD63 sont les plus utilisés Nom CD203c Ectonucleotide Pyrophosphatase Phospho-diesterase (E-NPP3) CD63 Lysozyme Associated Membrane Protein (LAMP-3) Exprimé par Basophiles, mastocytes PBMCs, plaquettes Basophiles quiescents Basophiles activés Expression constitutive faible Sur-expression - Non exprimé à la surface cellulaire - Exprimé à la surface des granules intracytoplasmiques Expression à la surface cellulaire Cinétique Rapide (5-15 min) Plus lente (10-25 min) Effet de l IL-3 Non induit par l IL-3 (ou processus lent, >90min) Induction par l IL-3 Magnitude de variation Données contradictoires dans la littérature Fonction Inconnue Associée à la libération des médiateurs 14
15 Principe CD203c et CD63 sont les plus utilisés Marqueurs d identification du basophile Marqueurs d activation du basophile NB : d autres marqueurs «d activation» décrits : : CD63 «like» : CD107a, plus associés à la dégranulation CD203c «like» : CD13, CD164, plus associés au «priming» et à l activation 15 Ebo DG, Allergy, 2006
16 Principe Protocole de routine au laboratoire : Marqueurs d identification du basophile Marqueurs d activation du basophile Témoin négatif Témoin positif Tubes tests PBS 20 µl Anti-IgE 20 µl Allergène dilué 20 µl CRTH2-FITC 10 µl 10 µl 10 µl CD203c-PE 10 µl 10 µl 10 µl CD3-PC5 10 µl 10 µl 10 µl Solution 100 µl 100 µl 100 µl d activation Sang (EDTA) 100 µl 100 µl 100 µl Vortexer et incuber 15 minutes à 37 C. Ajouter 2mL de solution de lyse Vortexer et incuber 10 minutes à température ambiante Centrifugation 5 minutes à 200g - Laver en PBS Reprendre avec du PBS / 0,1% PFA Vortexer 5 secondes et analyser au cytomètre 16
17 Principe Conditions importantes à respecter : Marqueurs d identification du basophile Marqueurs d activation du basophile Réalisation de contrôles: Contrôle négatif: en présence de tampon seul Contrôle positif : stimulation par anti-ige ou anti-récepteur FcεRI N.B. 10% de non répondeurs ( Syk) Réalisation des dilutions de médicaments: Au moins 3 dilutions en se basant sur le Prick Test et couvrant 3 log Utiliser des formes injectables Vérifier l absence de toxicité pour les basophiles Critères d interprétation des résultats: Expression en % de basophiles activés et/ou index de stimulation Seuil de positivité: 10% voire 5%, à définir pour chaque médicament Activation beaucoup plus faible que pour les allergènes protéiques 17
18 Principe Hypersensibilités médicamenteuses Ce qu il reste à faire Allergènes protéiques : excellente sensibilité à visée diagnostique pour le suivi de désensibilisation avant une réintroduction ou un TPO Très utile lorsque les tests de détection d IgE spécifiques ne sont pas disponibles pour les molécules impliquées : fréquent pour les médicaments Médicaments : haptènes : monovalents le plus souvent Sous-entend donc la liaison à une protéine porteuse pour pouvoir ponter deux IgE et induire le signal d activation Beaucoup plus difficile 18
19 Introduction Principe Pour quelles molécules? Hypersensibilités médicamenteuses Ce qu il reste à faire Béta-lactamines : Ebo DG et al., Expert Review,
20 Introduction Principe Pour quelles molécules? Hypersensibilités médicamenteuses Ce qu il reste à faire β lactamines : exemple de résultats Contrôle négatif Contrôle positif (anti-ige) Allergène (Clamoxyl ) CD203c CRTH2 20
21 Introduction Principe Pour quelles molécules? Hypersensibilités médicamenteuses Ce qu il reste à faire Curares : Ebo DG et al., Expert Review,
22 Introduction Principe Pour quelles molécules? Hypersensibilités médicamenteuses Ce qu il reste à faire La question des AINS : Ebo DG et al., Expert Review, 2011 Controversé, du fait du mécanisme non-ige médié d activation dans la plupart des cas : Déviation de la cascade de l acide arachidonique vers la production de leucotriènes Résultats positifs chez des sujets sains tolérants 22 Dose dépendant
23 Demande de TAB au laboratoire d Immunologie du CHLS entre 2012 et 2013 (n=1840) Curares Clamoxyl Rocephine Augmentin Pyostacine Produits de Contraste Platines Autres 30% curares 47% 3% 5% 1% 2% Antibiotiques 3% 9%
24
25 Introduction Principe Hypersensibilités médicamenteuses Ce qu il reste à faire Pour quelles molécules? Les quinolones : 34 patients BAT negative positive 17 patients 17 patients skin test skin test negative positive negative positive 13 patients 4 patients 4 patients 13 patients 13x 2x contraindicated 2x 1x 3x contraindicated challenge test 13x negative 15 patients with non-allergic hypersensitivity challenge test 2x negative challenge test 1x positive 1 patient with allergic hypersensitivity 13 patients with high probability of allergic hypersensitivity 25 Rouzaire P et al., Int Arch Allerg and Clin Immunol, 2012
26 Introduction En conclusion : Principe Hypersensibilités médicamenteuses Ce qu il reste à faire Mise au point TAB aux médicaments difficile : médicaments = haptènes monovalents le plus souvent Très utile lorsque la détermination des IgE spécifiques n est pas possible Intérêt pour la prise de décision de réintroduction d un médicament Utilité pour le choix d une molécule qui ne donne pas de réaction croisée Sensibilité faible, Spécificité excellente Nécessité d augmenter la sensibilité Nécessité de standardiser le test 26
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