(1) Le caryotype. Classement des chromosomes par paires Analyse / Recherche d anomalies TRANSLOCATIONS CHROMOSOMIQUES DANS LES HÉMOPATHIES MYÉLOÏDES

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1 TRANSLOCATIONS CHROMOSOMIQUES DANS LES HÉMOPATHIES MYÉLOÏDES TRANSLOCATIONS CHROMOSOMIQUES DANS LES HÉMOPATHIES MYÉLOÏDES (Leucémies Aiguës Myéloïdes) Master Pathologie Humaine Module «Génomique tumorale» (M2) I Hématopoïèse II Leucémies aiguës myéloïdes III Translocations chromosomiques Techniques d étude IV Mécanismes moléculaires des translocations et implications thérapeutiques Facteurs de et leucémies aiguës myéloïdes Mutations Dr M.J. MOZZICONACCI 29 novembre 2011 II Leucémies aiguës myéloïdes (LAM) Au moins 20% de blastes (cellules leucémiques) dans la moelle (OMS :Vardiman et al., 2002) 8 catégories M0 blastes indifférenciés M1 myéloblastes sans maturation granuleuse M2 myéloblastes avec maturation granuleuse M3 promyélocytes M4 myélomonocytaire M5 monoblastique M6 érythroleucémie M7 mégacaryoblastique OMS 2008 Vardiman et al.;vardiman, 2010 III REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES TECHNIQUES DE MISE EN EVIDENCE DES TRANSLOCATIONS OU DE LEURS EQUIVALENTS MOLECULAIRES (1) Le caryotype Classement des chromosomes par paires Analyse / Recherche d anomalies CARYOTYPE anomalie chromosomique HYBRIDATION IN SITU EN FLUORESCENCE (FISH) mécanisme de fusion au niveau de l ADN RT ou RQ-PCR détection du transcrit de fusion 1

2 Anomalies du caryotype Anomalies de nombre Hyperdiploïdie (>46 chromosomes) Hypodiploïdie (<46 chromosomes) Monosomies, trisomies, tétrasomies Anomalies de structure Translocations Délétions Inversions Insertions Chromosomes dicentriques (2) L hybridation in situ en fluorescence Fluorescence in situ hybridisation (FISH) Cytogénétique moléculaire Technique complémentaire du caryotype PRINCIPE DE LA FISH Basé sur les propriétés de dénaturation / re-naturation de séquences complémentaires d ADN : ADN à étudier et sonde marquée Préparation cytogénétique ou cytologique Sonde (séquence d ADN) (Marquage chimique) DIFFERENTS TYPES DE SONDES ADN séquence unique : Anomalies de structure YAC Yeast Artificial Chromosome (1 méga base) BAC Bacterial Artificial Chromosome (150 Kb) Cosmides (50Kb) Phages (20Kb) Plasmides (0,5 à 5 Kb) Dénaturation Hybridation Lavages Dénaturation ADN satellite Centromériques : Anomalies de nombre Télomériques : translocations, délétions terminales Peintures (cocktail de sondes) Détection de la fluorescence (3) RT-PCR Classique ou Quantitative (RQ-PCR) Mise en évidence des transcrits de fusion (ARN) (expression des gènes de fusion) Aide au diagnostic / pronostic Evaluation de la maladie résiduelle moléculaire IV - MÉCANISME MOLECULAIRE PRINCIPAL IMPLIQUÉ DANS LES TRANSLOCATIONS DES HÉMOPATHIES MALIGNES MYELOIDES Formation d un gène de fusion (Translocation chromosomique) 2

3 FORMATION D UN GENE DE FUSION 2 grands groupes de gènes sont impliqués dans les translocations des hémopathies malignes myéloïdes: Gènes codant pour des protéines à activité tyrosine kinase impliquées dans la signalisation cellulaire translocation prolifération, perte de l apoptose Syndromes Myéloprolifératifs (SMP) FORMATION D UN GENE DE FUSION 2 grands groupes de gènes sont impliqués dans les translocations des hémopathies malignes myéloïdes: Gènes codant pour des protéines à activité tyrosine kinase impliquées dans la signalisation cellulaire translocation prolifération, perte de l apoptose SMP Gènes codant pour des facteurs de dont les gènes cibles sont impliqués dans la différenciation cellulaire translocation dérégulation de la différenciation cellulaire, blocage de la maturation LAM Facteurs de Acétylation des histones nucléosomales et architecture chromatinienne Complexes co-répresseurs (HDAC) : Histone Déacétylases Complexes co-activateurs (HAT) : Histone Acétyl Transférases Facteurs de Transcription de gènes cibles Différenciation cellulaire dans les lignées hématopoïétiques Acétylation des lysines des queues d histones Ouverture chromatinienne Facilite Désacétylation des histones Compression chromatinienne Pas de Importance de l état d acétylation des histones D après Ait-Si-Ali et Harel-Bellan, 1999 Translocations impliquant des facteurs de dans les LAM Complexes co-activateurs (HAT) : Histone Acétyl Transférases CEBPA, ETS, MYB, SRC1, CBP, p300, TIF1a.. Complexes co-répresseurs (HDAC) : Histone Déacétylases NCoR, msin3a, SMRT 1. Core Binding Factor (CBF) 2. Récepteur α de l Acide Rétinoïque (RARA) 3. Membres de la famille HOX 4.Membres de la famille ETS 5. Protéines impliquées dans la régulation de la 3

4 (1) LES LEUCÉMIES CBF (CORE BINDING FACTOR) LES LEUCÉMIES CBF (CORE BINDING FACTOR) CORE BINDING FACTOR : Facteur de hétérodimérique 2 sous-unités (α ou AML1 et β) CBFα / AML1 / RUNX1 en 21q22, CBFβ en 16q22 Régule l expression de gènes impliqués dans la différenciation hématopoïétique normale Translocations impliquant une des 2 sous-unités CBF dans 25% des LAM LAM2 t(8;21)(q22;q22) CBFα /ETO LAM t(3;21)(q26;q22) CBFα /EVI1 Mauvais pronostic LAM4 Eo inv(16)(p13q22) ou t(16;16)(p13;q22) CBFβ/MYH11 LAL pré-b t(12;21)(p13;q22) ETV6/CBFα Bon pronostic LAM sensibles à l aracytine à hautes doses Pronostic favorable Rôle de CBFα/AML1/RUNX1 dans la Mécanisme d action de la fusion CBFα-ETO : leucemogenèse Recrutement du complexe co-activateur Activation de la Répression de la Recrutement du complexe co-répresseur Répression de la ETO n est pas exprimé normalement dans les cellules hématopoïétiques CBFα-ETO recrute le complexe co-répresseur HDAC sur la partie ETO NCoR : Nuclear CoRepressor, HDAC : Histone Déacétylases CBFα-ETO a un effet dominant négatif inhibiteur sur CBFα sauvage I Translocations impliquant des facteurs de dans les LAM 1. Core Binding Factor (CBF) 2. Récepteur α de l Acide Rétinoïque (RARA) 3. Membres de la famille HOX 4. Membres de la famille ETS 5. Protéines impliquées dans la régulation de la 4

5 En présence d ATRA à dose physiologique (10-8 M), RARA interagit avec le complexe Co-activateurs nucléaires - Histone Acétyl Transférase (HAT) : Activation de la En présence d ATRA à dose physiologique (10-8 M), RARA interagit avec le complexe Co-activateurs nucléaires - Histone Acétyl Transférase (HAT) : Activation de la PML-RARA, dominant négatif sur RARA, recrute le complexe co-répresseur nucléaire (NCoR)-Histone Déacétylase (HDAC) : Répression de la même en présence d ATRA 10-8 M 5-10% des LAM3 n ont pas la t(15;17) en cytogénétique PML-RARA positives (translocation masquée ou variante) PML-RARA présente une plus grande affinité pour les corépresseurs que RARA augmenter la dose d ATRA pour lever la répression (10-8 M 10-6 M) L ATRA à dose pharmacologique (10-6 M) induit la dissociation du complexe co-répresseur et recrute le complexe co-activateur ex : LAM3 à caryotype normal PML-RARA positive en RQ-PCR FISH double couleur PML - RARA Insertion de RARA dans PML puis translocation (1;15) fusion PML-RARA sur le 1p Sensible à l ATRA RARA et un autre partenaire PLZF Promyelocytic Leukemia Zinc Finger t(11;17)(q23;q21) résistance à l ATRA Sensibilité à l ATRA : LAM3 t(11;17)(q23;q21) PLZF - RARA positif en RT-PCR Insensible à l acide tout-trans rétinoïque Cytologie évocatrice : Noyau régulier Cytoplasme hypergranuleux NPM Nucleophosmin t(5;17)(q35;q21) NuMA Nuclear Matrix Associated t(11;17)(q13;q21) STAT5b der(17) 5

6 EFFETS DE L ATRA SUR LES CELLULES DE LAM3 Dans la fusion PLZF-RARA, PLZF recrute aussi un complexe co-répresseur : Absence de réponse à l ATRA même à 10-6 M Induit la différenciation cellulaire : levée du blocage de maturation maturation morphologique promyélocytes polynucléaires maturation fonctionnelle : réduction du nitrobleu de tetrazolium (NBT) en bleu de formazan Entraîne la dégradation de la protéine PML-RARA clivage par les caspases dégradation par le protéasome A. Translocations impliquant des facteurs de dans les LAM 1. Core Binding Factor (CBF) 2. Récepteur α de l Acide Rétinoïque (RARA) 3. Membres de la famille HOX 4. Membres de la famille ETS 5. Protéines impliquées dans la régulation de la Les gènes de la famille HOX (gènes homéotiques) Domaine homéobox liaison à l ADN (motif hélice-boucle-hélice) Gènes ayant un rôle dans développement embryonnaire des mammifères et l hématopoïèse normale Codent pour des facteurs de Cibles de facteurs de Les gènes de la famille HOX (4 complexes) Complexe Antennapedia Complexe Bithorax (région antérieure) (région postérieure) Drosophile 7p q q q31-37 Groupes paralogues Conservation des gènes chez l homme avec duplications et pertes 6

7 Translocations impliquant des membres de la famille HOX Plusieurs translocations dans la pathologie myéloïde Les gènes HOX peuvent être impliqués directement dans les translocations, ou dérégulés par des translocations impliquant leurs régulateurs t(7;11)(p15;p15) t(2;11)(q31;p15) Directement NUP98 - HOXA9 (7p15) NUP98 - HOXD13 (2q31) NUP98 = nucléoporine (circulation des ARN et protéines entre noyau et cytoplasme) en 11p15 Surexpression de HOX avantage de prolifération et inhibition de la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques (HOXA9) Mécanismes d action possibles de la fusion NUP98-HOX dans les LAM Dash and Gilliland, 2001 CDX2 (REGULATEUR DES GENES HOX) ET LEUCEMOGENESE Indirectement Translocations impliquant des régulateurs des HOX t(12;13)(p13;q12) : ETV6-CDX2 Translocations impliquant MLL (11q23) - Exprimé dans la partie postérieure durant l embryogenèse : contrôle le développement axial et l élongation en régulant les gènes HOX. - 90% des LAM ont une expression monoallélique de CDX2 et une expression ectopique ( ) CDX2, MLL : régulateurs des HOX A Translocations impliquant des facteurs de dans les LAM 1. Core Binding Factor (CBF) 2. Récepteur α de l Acide Rétinoïque (RARA) 3. Membres de la famille HOX 4. Membres de la famille ETS 5. Protéines impliquées dans la régulation de la Translocations impliquant des facteurs de de la famille ETS Régulateurs nels Gène ETV6 (ETS Variant gene 6) en 12p13 LAM et LAL Nombreux gènes partenaires (>30) dans les translocations t(3;12)(q26;p13) EVI1-ETV6 LAM t(4;12)(q11;p13) BTL-ETV6 LAM/LAL t(9;12) (q34;p13) ABL-ETV6 LAM Souvent translocation + délétion du 2ème allèle de ETV6 7

8 : upregulation nelle Intron 1 BTL ACS2 TTL PER1-AS Intron 2 MN1 MDS1-EVI1 BTL CDX2 PAX5 HLXB9 MDS2 STL Intron 3 MN1 Intron 4 ARNT Intron 5 RUNX1 Exemples Intron 4 PDGFRB ABL1 NTRK3 JAK2 Intron 5 JAK2 ABL1 ABL2 NTRK3 FGFR3 SYK ETV6 ETV6-ABL1 ABL1 (TK) ETV6-RUNX1 SH3 SH2 TK DNA binding Actin binding Gènes de fusion partenaires de ETV6 RUNX1 (TF) RUNT Activation ABL1 : protéine tyrosine kinase RUNX1/AML1 : facteur de Bohlander SK et al, 2005 A Translocations impliquant des facteurs de dans les LAM 1. Core Binding Factor (CBF) 2. Récepteur α de l Acide Rétinoïque (RARA) 3. Membres de la famille HOX 4. Membres de la famille ETS 5. Autres protéines impliquées dans la régulation de la Protéines impliquées dans la régulation de la Régulent la structure chromatinienne CBP (CREB Binding Protein) en 16p13 (activité HAT) p300 en 22q13 (activité HAT) MLL (Mixed Lineage Leukemia) en 11q23 Translocations : MLL-CBP MLL-p300 MOZ-CBP t(11;16)(q23;p13) t(11;22)(q23;q13) t(8;16)(p11;p13) MOZ-p300 MOZ-TIF2 t(8;22)(p11;q13) inv(8)(p11q13) t(8;16)(p11;q13) / Fusion MOZ-CBP MOZ : MOnocytic leukemia Zinc finger protein en 8p11 (MYST3) Activité HAT CBP : CREB Binding Protein en 16q13 Protéine nucléaire Régule la en remodelant la chromatine par acétylation des histones : recrute les HAT Co-activateur de facteurs de impliqués dans la réparation de l ADN, la différenciation cellulaire et le développement embryonnaire MOZ-CBP : dans des LAM monoblastiques Modification de l acétylation des histones dérégulation de l expression des gènes cibles de CBP Le gène MLL est l homologue humain du gène Trithorax de la drosophile MLL est réarrangé surtout dans les LAM4 et LAM5 (composante monoblastique), souvent secondaires Gène multi-partenaire : plus de 50 gènes partenaires Le pronostic est actuellement fonction du partenaire t(9;11)(p22;q23) intermédiaire t(10;11)(p12;q23) très défavorable t(6;11)(q27;q23) défavorable La fusion conserve la partie N terminale de MLL qui leucémogenèse 8

9 MLL N 3 crochets AT (fixation petit sillon ADN) DNA methyltranferase homology/repression domain Points de cassure (exons 8-13) Transcriptional activation domain Doigts de zinc Histone methyltranferase domain Partenaire Protéine de fusion (translocations MLL) Duplication partielle en tandem (exons 5-12) MLL-CBP MOZ-CBP Enfants Adultes Fusions CBF, RARA, HOX autres (1q32) EPS15 ELL AF6 AF9 AF10 autres AF9 (9p23) (19p13.1) ELL ENL (19p13.3) (6q27) AF6 AF10 (10p12) Facteurs de hématopoïétiques CBP MLL ~ 50 partenaires de translocation RNA pol II Gènes cibles RNA pol II : machinerie nelle basale (plus de 40 protéines) Knock-in AML1-ETO et CBFβ-MYH11 seuls chez la souris ne donnent pas une leucémie Souris transgéniques PML-RARA développent une leucémie aiguë mais d installation progressive, avec une phase pré-leucemique de durée variable Souris transgéniques PLZF-RARA développent une phase pré-leucémique myéloproliférative d environ 3 mois, puis une leucémie aiguë => La leucémie aiguë résulte de la coopération de plusieurs évènements moléculaires FLT3 ITD, mutations mutations RAS... Avantage de prolifération et/ou activité anti-apoptotique Inhibiteurs de FLT3 Inhibiteurs de Farnesyl Tranférase... D après Gilliland and Griffin, 2002 LAM PML-RARA AML1-ETO CBFβ-MYH11 t(mll)... Inhibition différenciation ATRA Chimiothérapie 9

10 MUTATIONS FLT3 récepteur à tyrosine kinase Internal Tandem Duplications 15-30% LAM Mutations ponctuelles 5-10% LAM Mauvais pronostic <60 ans, LAM3, caryotypes normaux Anti FLT3 : CEP-701, PKC NPM1 Nucléophosmine - Nucléolaire - Mutations dans 50-60% des LAM à caryotype normal - Surtout LAM M4 et 5 - Bon pronostic - Mutations localisation cytoplasmique de NPM - 26 mutations décrites / Insertions Falini et al., 2005 Gène NPM1 CEBPA 10% LAM, surtout LAM -M1 et M2 Essentiellement LAM du groupe de pronostic intermédiaire Mutation / perte de fonction : bon pronostic (sauf si associée à mutation FLT3) NES : Nuclear export signal; NLS: nuclear localisation signal; NoLS: nucleolar localisation signal Mutations Chen et al., 2006 Insertion de nucléotides mutation au niveau d un tryptophane (W) dans le domaine NoLS FLT3 Recherche de mutations dans les LAM à caryotype de pronostic intermédiaire muté Non muté Mauvais pronostic NPM1 muté Non muté allogreffe CEBPA muté bon pronostic bon pronostic CONCLUSIONS Intérêt de la recherche et de la caractérisation des translocations dans les hémopathies malignes Marqueurs pronostiques Evaluation de la maladie résiduelle Identification des gènes impliqués traitements plus ciblés, plus efficaces et moins toxiques Perspectives : mutations, coopération entre les différents réarrangements combinaisons de traitements 10