Signalisation cellulaire. Cours n 2 (19/09/13)

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1 Signalisation cellulaire Cours n 2 (19/09/13) C) Les protéines de la signalisation : Les protéines kinases Les protéines phosphatases Les Guanosines Triphosphatases (GTPases) Les protéines adaptatrices I. Phosphorylation des protéines : Action réversible Modification post traductionnelle la plus courante Effet activateur/inhibiteur Régule différents processus : métabolisme, motilité, canaux membranaires, assemblages du noyau, cycle cellulaire I.1. L effet de la phosphorylation sur la structure et la fonction des protéines : 99% des phosphorylations sur résidus Ser et Thr 1% sur résidus Tyr Les Eubactéries et Archae phosphorylent sur des résidus His et Asp (pas d identification chez eucaryotes en labo encore, moins facile à mettre en évidence) Transfert du γphosphate à demander Le volume occupé par chaînes latérales de Tyr est beaucoup plus important que Ser et Thr phosphorylées. I.2. Influences de la phosphorylation : Très importantes, 2 modèles : 1 Enzyme isocitrate déshydrogénase : site catalytique phosphorylable (groupement P occupe un volume 2 conséquences : a. Substrat de cet enzyme ne peut pas venir se faire catalyser empêchement de l enzyme d exercer sa fonction : gêne, encombrement stérique

2 b. Groupement phosphate apporte des charges négatives répulsions électrostatiques 2 Ykinase Src : Tyr 527 : Phosphorylation Interagit avec le domaine SH2 et la conformation Domaine kinase nonaccessible à des effecteurs Les protéines kinases : 1 Origine : Protéines kinases très nombreuses, après analyse la séquence codant pour le domaine kinase hautement conservé au cours de l évolution, à l origine il y avait 1 gène ancestral dupliqué à plusieurs reprises, ces séquences ont été modifiées au cours de l évolution. Sur le schéma, la conservation du domaine kinase est reflétée par le code couleur tous les domaines kinases sont de la même couleur Les séquences codant pour le domaine kinase peuvent être prolongés par une séquence en Nterm ou Cterm séquences additionnelles où il peut y avoir d autres domaines Ex : Protéine kinase G : séquences PS (pseudosubstrat) : Forte affinité pour le domaine kinase, interagit avec site catalytique de la kinase Occupe le site catalytique et empêche les autres substrats de s y fixer Inactive la protéine kinase

3 Les PS ont une affinité pour le site catalytique mais n ont pas l AA accepteur du phosphate D autres séquences à côté du PS reconnaissable par 2 nd messager comme par le GMPc Voies de signalisation : conduisent à l activation des enzymes générant du GMPc interaction avec les séquences à côté du PS extraire le PS du domaine catalytique de la kinase activation de la kinase en libérant site catalytique pouvant activer des effecteurs Autre exemple : le PKCα et les séquences régulées par le diacide glycérol et le Ca 2+ (complexe calmoduline/ca 2+ )) Comme le PKG, présente les séquences au PS qui en temps normal va interagir avec le site catalytique de la kinase et inactive la kinase Ces voies de signalisation conduisant à la synthèse du diacide glycérol ou la libération du Ca 2+ par les réservoirs calciques Le diacide glycérol et le Ca 2+ vont interagir avec ces séquences et extraire le PS du site catalytique pour libérer l accès du site et activer la kinase. Les séquences codant pour les protéines kinases peuvent être associées donc à des séquences régulatrices d activité kinase ainsi que d autres types de séquences qui vont aller localiser la kinase au niveau subcellulaire : Ex : La kinase PKBAKT présente en NTerm un domaine PH : domaine PH présente une affinité pour les phosphoinositides (trouvés au niveau de la membrane plasmique) ce domaine va localiser la kinase PKBAKT vers la membrane plasmique Récepteur NGF : La séquence du domaine kinase est associée à un domaine transmembranaire et extracellulaire. Conduisent et logent la protéine kinase au niveau de la membrane plasmique.

4 Nombre variable de protéines kinases chez les différentes espèces : Eucaryotes : 2000 protéines kinases (116 gènes codant pour une kinase) Nématode : un peu plus de 400 Vertébrés : un peu plus de 800 II. 2. Domaine catalytique : structure : (Fonction de la Tyr527 : lorsqu elle est phosphoryle elle va interagir avec le domaine SH2 et la conformation de la molécule est telle que la kinase n est pas accessible avec ses effecteurs) 230 AA codent le domaine kinase la séquence d AA s organise dans l espace sous forme de 2 lobes qui entourent le domaine de liaison à l ATP. Comparaison de toutes les séquences des domaines kinases : Au niveau de la structure primaire des AA, pas beaucoup de conservation ; cependant au niveau de toutes les séquences codant pour le domaine kinase, on s aperçoit qu elles se replient dans l espace pour ramener quelques AA hautement conservés, essentiels à la fonction de phosphorylation se replient de la même manière en 2 lobes entourant le site de liaison ATP. 1 kinase phosphoryle un ensemble de substrat, d effecteurs dans un contexte particulier Ex : GMPc ou AMPc dépendantekinase : Effecteurs qui vont être phosphorylés par la GMPc ou AMPcdépendante kinase ont en commun un résidu Thr précédé en 2 et 3 par AA basique (chargé +) Spécificité de réaction due au bras accepteur de l AA accepteur du groupement phosphate de la protéine kinase qui puisse avoir une morphologie compatible avec la morphologie du site catalytique (si un enfant veut faire passer un objet dans un trou carré, il faut que l objet soit carré) + compatibilité au niveau des charges + compatibilité localisation subcellulaire, tissulaire, lors de l expression régulée des gènes

5 Ex : une protéine kinase dirigée vers la membrane plasmique ne pourra pas phosphoryler une protéine mitochondriale importance des domaines qui régulent les interactions protéines/protéines L expression des gènes codant pour la kinase dépendante du stress, développement et autres facteurs II. 3. Régulation de l activité kinase : plusieurs stratégies Phosphorylation : changement conformationnel (Rc à l insuline, Src) : ex : Rc de l insuline (type tyrkinase) : Rapproche les 2 domaines kinases Phosphorylation en trans sur la boucle qui recouvre en temps normal le site catalytique Changement de conformation et libération du site catalytique pour d autres substrats Régulation de la liaison du substrat (CaMK II ou MLCK) : CaMK II voir protéine PS Ciblage de kinases dans des endroits spécifiques (Src, PKB, PDK1) : Ex : PKB : domaine PH qui interagit avec le PIP membranaire et se trouve à proximité de PDK1 PDK1 phosphoryle PKB et va l activer (futur TD sur la voie de signalisation de l insuline)

6 II. 4 Kinases et pathologie : Certaines kinases ont été impliquées dans des pathologies : CDK4 : Kinases, ssu catalytiques capables de phosphoryler et s associer à la sous- unité régulatrice qui est la CyclinD Le complexe CDK4/CyclinD intervient dans la transition de la phase G1 du cycle cellulaire et notamment dans la transition du point de restriction Il existe pas mal de pathologies (sarcome, carcinome) de poumon, où l on a observé une amplification du gène codant pour la kinase CDK4 Une pathologie : mélanomes ubiquitaires on a pu mettre en évidence une mutation ponctuelle hyperactivation de la kinase III. Les protéines phosphatases : Différentes familles de phosphatases avec différentes spécificités : S/T et /ou Y Soustraient un groupement phosphate à un résidu phosphorylé Plus de 1000 phosphatases chez eucaryotes Spécificité (comme les kinases) S/T phosphatase et Y phosphatase Domaine phosphatase associable à d autres séquences qui vont réguler l activité de l enzyme, interaction avec effecteur et localisation dans la cellule de l enzyme

7 A. Sérine/thréonine phosphatases : * PPP : Métalloenzyme qui ont dans leur site catalytique 2 ions métalliques (Fe, Mn, Zn )) Chez euarchaebactéries, tous les eucaryotes, tous les substrats ne sont pas tous connus, interviennent dans régulation du cycle cellulaire (nucléation des MT, transition du cycle cellulaire ) 3 nouvelles familles PPP : PP4 : nucléation des MT dans le centrosome PP5 : régulation de la transcription des ARNr PP6 : transition de la phase G1S Ex : PP2B ou Calcineurine : 2 ssu 1 catalytique (ion Fe + Zn) au niveau de sa séquence, présente une séquence autoinhibitrice (capable d interagir avec le site catalytique de la phosphatase et de l occuper) et interagit avec l autre ssu L autre ssu lie le Ca 2+ mais n est pas régulé par le [Ca 2+ ] intracellulaire Calmoduline : petite protéine cytosolique interagit avec Ca 2+ et déloge la séquence inhibitrice de la PP2B. PP2B intervient dans les voies de signalisation. Où les Rc des Lymphocytes T sont activés Poser une question : estce que c est le fait d activer les Rc des LT qui induit la libération de Ca2++? Les Rc des LT sont activés induisent la libération des réservoir de Ca 2+ intracellulaire qui interagit avec calmoduline et qui active PP2B PP2B déphosphoryle le facteur de transcription NFAT NFAT une fois déphosphorylée va pouvoir partir dans le noyau où il active le gène codant l IL2 stimule les LT à proliférer. [Cible de 2 médocs lors de greffes : cyclosporine et FK506] * PPM : Exprimée dans tous les règnes Possède dans son site catalytique 2 ions Mn 2+, impliqué dans la déphosphorylation de kinases activé par stress

8 B. Tyrosine Phosphatases : PTP : Fait l objet de beaucoup de labos car provient dans la régulation de la prolifération cellulaire (cancer) et de la réponse immune Grand sousfamille divisible en 4 sousfamilles : o Tyrphosphatase (RTK) o Phosphatases à double spécificité (capable de déphosphoryle la Tyr et des phosphosérines et phosphothréonines) RTP, VHR, Cdc25 (pas celle de faible PM) 2 types de Tyrphosphatases : Cytosolique séquence d adressage (cas du PTP1B) en Cterm de résidus hydrophobe localisant la protéine vers la membrane du réticulum endoplasmique Transmembranaire CD dans la membrane plasmique chez les LT et LB, corécepteur, capable d induire la libération du 2 nd messager des réservoirs de Ca 2+ cytosolique, 2 domaines catalytiques (1 est fonctionnel, proche de la MP ; l autre est inactif (retrouvé chez d autres phosphatases) mais peut interagir avec des substrats phosphoryles sur des résidus Tyr at- il évolué pour des interaction prot/prot?) La sousfamille à double spécialité : La profondeur de leur site catalytique est inférieure à celles des Tyr- phosphatase Le domaine des TyrP est profond de 0,9 nm > domaine des double- spécifiques, d où leur capacité à déphosphoryler Ser, Thr, Tyr phosphorylées. Couples kinase/phosphatase dans les voies du stress permet que le signal soit transitoire Ex : stress cytokine inflammatoire cascade de transduction du signal de phosphorylation kinases terminales (ex : p38) kinase activé par phosphorylation et phosphorylent à leur tour des effecteurs (facteurs de transcription) la phosphatase étroitement lié à la kinase va déphosphoryler la kinase derrière (La phosphatase va être ellemême activée par une kinase présente dans la cascade de phosphorylation mais pas celle à laquelle elle est liée) Ex : MKP3 et ERK2, JNK(kinase)/SAPK

9 Lorsque ces kinases sont activées, elles ont le temps de phosphoryler leurs substrats mais elles sont très rapidement déphosphorylées ; cela les inactive et rend le signal transitoire. La sousfamille de cdc25 : Régule positivement le cycle cellulaire en déphosphorylant Cdk1 et Cdk2 Phosphatase Progression du cycle cellulaire régulé par dimères (Cdk1/cycb ) Selon niveau de phosphorylation, cycb et Cdk1 activé ou non. Ex : phosphorylation par CAK activation Phosphorylation par Wee/Myt1 : en T14, Y15 après cette phosphorylation, même si phosphorylation par CAK, ce dimère restera inactif Cdc25 permet la déphosphorylation des 2 résidus (T14, Y15) de la phosphorylation du à Wee/Myt1 et permet la transition G2/M IV. Les protéines G :

10 IV.1 Intro : Lie et hydrolyse le GTP Régulent : transduction des signaux, cytosquelette, trafic membranaire, transport nucléaire, synthèse protéique Gènes anciens, toutes les formes de vie possèdent des protéines liant le GTP pour réguler la synthèse protéique Différentes sousfamilles : petites GTPases, GTPases hétérotrimériques, facteurs d élongation, GTPases apparentées à la dynamine On ne verra que les petites GTPases et les GTPases hétérotrimériques Toutes les protéines G ont un domaine d interaction avec le GTP Se compose d un feuillet bêta de 6 brins et de part et d autre on a 5 hélices alpha. Le GTP se loge dans un petit sillon peu profond, formé par les boucles qui relient les structures secondaires entre elles Cette séquence fait 200 AA et compose la majorité des petites protéines G Les grandes protéines G (ex : EFTuGTP) ont leur domaine GTPasique associables à d autres domaines pour interaction prot/prot etc Il y a 2 conformations : associée au GTP : active associée au GDP : inactive * Passage de la forme active à inactive = hydrolysation du GTP en GDP+Pi par GAP * Passage de la forme inactive à active = ajout de GTP par GEF Boucle Switch I et II à conformations différentes selon qu elles soient associées au GTP ou GDP GEF βphosphate du GDP qui s en va et protéine G interagit avec GTP IV.2 : Structure du site GTPasique : IV.3 : Cycle de liaison au GTP :

11 IV.4. La famille des petites GTPases : Rab, Arf, Sar et Ran : trafic intracellulaire des vésicules membranaires, transport nucléaire, assemblage du fuseau mitotique Ras : transduction du signal régulant la croissance cellulaire Rho : cytosquelette d actine et polarité cellulaire Grb2 = molécule adaptatrice, pas d activité enzymatique intrinsèque, domaine d interaction prot/prot, 2 domaine SH3 et 1 domaine SH2 (reconnaît l une des Tyr phosphorylée dans la partie Cterm des Rc activés et ramène la molécule SOS qui est une guanine exchange factor pour la petite protéine Ras, qui se situe au niveau de la MP attachée avec une AG (farnésylée)) IV.5 Protéines G hétérotrimériques :

12 Interviennent en aval des R7HTM 16 gènes codant pour la ssu α, 6 pour β, 12 pour γ chez eucaryotes Pour ssu α, les 16 gènes peuvent être épissés de différentes façons ssu α encore plus nombreuses possibilités Si chaque ssu pouvait être recombiné nb infini de trimère possible? non, on a un nombre plus faible d hétérotrimères Plus de R7HTM différentes que de protéines G hétérotrimériques Ex : αolf est la même pour tous les R7HTM activant l odeur Cterm est associé à un AG qui ancre la ssu α à la membrane La ssu β présente une structure particulière : semblable à une hélice de bateau à 7 modules qui présente 2 interfaces : une interagissant avec la ssu α et l autre avec γ. L interaction β/γ (+++) mais interaction β/α régulée. La ssu β n est pas associée à la MP, c est la ssu γ qui est associé à un autre AG qui l ancre au niveau de la membrane le dimère β /γ, comme la ssu α, est au niveau de la membrane plasmique. Quand un R7HTM fixe un ligand, il y a changement conformationnel qui implique au moins 2 hélices transmembranaires qui répercute sur boucles cytoplasmiques et qui répercute sur protéine G hétérotrimérique. Et le GDP s en va et sera remplacé rapidement par du GTP dissociation de ssu α du dimère β /γ Ssu α activé agit sur ses propres effecteurs (ADNc qui va agir comme second messager de l AMPc qui va luimême avec d autres enzymes agir)

13 Certaines séquences reviennent assez souvent pour pourtant protéines assez différentes s allongent dans l espace pour domaines à interaction prot/prot ou prot/lipides Les noms attribués à ces domaines ne représentent pas leur activité ; ils renseignent en général sur les protéines dans lesquelles on a identifié ces séquences en premier. Ex : domaines SH1, SH2 (domaine d interaction à la tyrosine phosphoryle), SH3 (interagit avec des séquences riches en proline) SH = domaine homologique à la protéine kinase Src Domaines à fonction importante : celle de permettre la formation de complexes entre différents protéines Au sein de ces complexes, il va y avoir une suite de réactions et finalement, ces domaines qui permettent la formation de ces complexes, assurent et garantissent la bonne suite des réactions, elles favorisent et sécurisent cette suite de réaction. Les molécules qui appartiennent à une famille de domaines, interagissent avec d autres séquences similaires mais présentent des affinités différentes Les interactions entre ces domaines avec nos séquences cibles sont faibles. Certaines interactions entre ces domaines adaptateurs et leurs séquences cibles va dépendre de modifications posttraductionnelles comme la phosphorylation. V) Domaines adaptateurs : Les domaines adaptateurs permettent l'assemblage de plusieurs protéines en unités fonctionnelles multimoléculaires dont le rôle est de réaliser une série de réactions.

14 Les interactions entre certains domaines adaptateurs et leur ligand font intervenir des modifications covalentes réversibles, telles que la phosphorylation. 1) Domaines interagissant avec des séquences phosphorylées : Domaine SH2 : trouvée dans la protéine kinase Src reconnaît des séquences ayant des Yphosphorylées suivi par un AA hydrophobe en position +3 Exemple bénin : prise et câble d alimentation première cavité dans laquelle va pénétrer la Yphosphorylée et c est elle qui va apporter le plus d énergie au niveau de la force de liaison, puis une deuxième cavité dans laquelle la chaine latérale de l AA hydrophobe va s insérer. Domaine PTB : constitué par ses brins beta s organisant entre eux en tonneaux surmonté par 7 hélices alpha trouvé dans des protéines qui vont interagir avec les Yphosphorylées au niveau des Cterm des domaines Ykinase. Interaction avec un ligand peptidique où la phosphotyrosine est située en C- term Domaine 1433 : 7 gènes codant pour ces domaines Agissent sous forme homo ou hétérodimères Chaque monomère est capable de reconnaître une séquence dans laquelle on a une phosphosérine centrale Retrouvées dans les protéines de voies de signalisation de l insuline Domaine WW : Domaines minuscules formés par 2 brins, retrouvés dans plus de 100 protéines Retrouvées dans une centaines de protéines d ubiquitinylation Capable de lier les peptides renfermant des phosphosérine ou phosphothréonine Domaine PH : Domaine assez fréquent

15 Retrouvé dans PKB, PLC, PIP2.. Sa structure rappelle un peu la structure du domaine PTB, brins β surmontés par hélices α, mais n interagissent pas avec le même peptide ligand ; Forte affinité avec phosphoinositides et se lient à eux Amène la protéine dans la membrane plasmique où l on trouve les phosphoinositides Ex : PIP2, PLCγ 2) Les autres domaines : Domaine SH3 : Lient des peptides riches en prolineproline situés à la surface de protéines spécifiques Domaine EVH1 : Lient les séquences riches en proline de type II qui s arrangent sur une face de ce domaine en hélices. Même structure tridimensionnelle que les domaines PH et PTB Domaine PDZ : psd95, disglage, ZO1 Ces domaines contribuent à l ancrage des protéines transmembranaires au cytosquelette et le maintien des complexes des voies de signalisation. En général, le domaine PDZ se lie à une région courte du Cterm d autres protéines spécifiques, qui se lient à PDZ par une augmentation de feuillets bêta. Le feuillet β dans le domaine PDZ est donc extendu par l addition d autres chaînes de β depuis la queue de la protéine qui s y lie. PDZ est retrouvé dans de nombreuses protéines d eucaryotes et d eubactéries, mais très peu chez les Archae. Ils sont souvent associés avec d autres domaines, et ces combinaisons permettent l activité de fonctions spécifiques. Ex : Dans la protéine PSD95, PDZ est associée avec le domaine SH3 et le domaine guanylate kinase. Domaine EH : Petits domaine par 4 hélices α, reconnaissent une séquence spécifique (AspProPhe) d où NPF.

16 Résumé des fonctions de quelques domaines : (selon QCM sur Jalon) Domaine SH2 ligand peptidique commençant par une phosphotyrosine en Nterm Domaine SH3 ligand peptidique riche en proline situé en surface de la protéine cible Domaine EVH hélice riche en proline de type II Domaine EH peptide ligand comportant la séquence NPF Domaine PTB ligand peptidique avec une phosphotyrosine en Cterm Dimère de protéines ligand peptidique avec une phosphosérine centrale Domaine PH phosphoinositides